امکان‌سنجی تولید کیتیناز از جدایه بومی Beauveria bassiana

فصلنامه انسان و محیط زیست، شماره 45، تابستان 97

امکان­سنجی تولید کیتیناز از جدایه بومی Beauveria bassiana

معصومه کردی [1]

الناز فهیمی [2]

ناصرفرَخی [3]^*

n_farrokhi@sbu.ac.ir

چکیده

کنترل بیولوژیک روش جایگزین مناسبی برای روش­های شیمیایی مبارزه با آفات می­باشد. قارچ بیمارگر حشرات Beauveria spp. میزبان هدف را از طریق نفوذ در کوتیکول، با ترشح آنزیم­های تجزیه کننده کوتیکول از قبیل کیتینازها مورد حمله قرار می­دهد. کیتینازها قادرند کیتین را هیدرولیز نمایند  و در زمینه­های مختلفی از جمله کنترل بیولوژیک، اصلاح زیستی آب دریا، تولید حشره­کش­ها و مواد دارویی استفاده می­شود. در این تحقیق فعالیت­های آنزیم کیتیناز در قارچ Beauveria bassiana  که در سه محیط مختلف کشت داده شده بود به روش رنگ­سنجی مورد مطالعه قرار گرفت. گونه قارچی بومی استفاده شده از مینودشت با قدرت بیماری­زایی بالا جداسازی و شناسایی گردید،  نتایج نشان داد که بیش­ترین غلظت آنزیم کل مربوط به محیط کشت P(7) می­باشد.بیش­ترین فعالیت آنزیم در محلول رویی محیط کشت Pontecorvo با 7 = pH ، در دمای 50 درجه سانتی­گراد به عنوان نمونه آنزیمی، در روز سوم کشت و در حضور کیتین­کلوئیدی 75/0 درصد اندازه­گیری شد، که نتایج حاصله می تواند در تولید بیشتر آنزیم کیتناز بکار گرفته شود و بدین ترتیب شاهد کاربرد آن در کنترل بیولوژیک به­منظور حفظ سلامت انسان و محیط زیست باشیم.

کلمات کلیدی: Beauveria spp.، کیتین، آنزیم کیتیناز، کنترل بیولوژیک.

Chitinase production from a native isolate of Beauveria bassiana

Masoumeh Kordi ^[4]

Elnaz Fahimi ^[5]

Nasser Farrokhi ^[6]*(Corresponding Author)

n_farrokhi@sbu.ac.ir

Abstract

Biological control is a suitable substitute technique for chemical battle with pests. Enthomopathogenic fungus Beauveria spp. attacks its target host by penetrating into cuticle through secretion of hydrolytic enzymes such as chitinases. Chitinases are capable of hydrolyzing chitins with many other applications in biocontrol, sea bioremediation, and development of biopesticides, pharmaceuticals. In this research, chitinase enzyme activities from Beauveria bassiana fungus, cultured in 3 culture media, were measured through a colorimetric assay. A native isolate with high mortality rate isolated and identified from Minoodasht. The highest chitinase activity was achieved at day 3 when incubated at 50 ˚C in Pontecorvo medium containing 0.75% colloidal chitin (pH = 7). Our results might be useful for higher production of chitinase that can be implemented in biological control and further elevate human health and environmental biosafety.  

Key words: Beauveria spp., chitin, chitinase enzyme, Biological control.

مقدمه

استفاده گسترده و روز افزون از حشره­کش­های شیمیایی برای کنترل آفات، توجه محققین را به نکاتی از قبیل هزینه­های گزاف تولید سموم شیمیایی، خطرات محیط زیستی ، گسترش مقاومت در حشرات آفت، باقی­مانده سموم در موادغذایی و اثر روی عوامل غیرهدف و حشرات مفید معطوف داشته است. از راهکار­های کاهش استفاده از آفت­کش­های شیمیایی، تولید آفت­کش­های بیولوژیک مبتنی بر قارچ­های بیمارگر حشرات است، که جهت کنترل آفات اهمیت زیادی دارند. قارچ بیمارگر حشرات Beauveria spp. با دامنه میزبانی بسیار گسترده، به عنوان آفت­کش بیولوژیک منحصر به فردی جهت کنترل بیولوژیک بسیاری از حشرات آفت، در دنیا ثبت شده است (1، 2). این قارچ میزبان هدف را از طریق نفوذ در کوتیکول با ترشح آنزیم­های تجزیه کننده کوتیکول از قبیل کیتیناز­ها، پروتئاز­ها و سایر آنزیم­ها مورد حمله قرار داده و بیماریزایی قارچ با تجزیه کیتین و پروتئین و سایر ترکیبات کوتیکول شروع می­گردد (1، 2). کیتینازها، آنزیم­هایی هستند که قادرند کیتین را به الیگومرها و یا مونومرها هیدرولیز نمایند (3، 4). تجزیه آنزیمی کیتین توسط کیتیناز موجب تولید محدوده وسیعی از مشتقات کیتینی مثل استیل­گلوکزآمین و دی­استیل­کتوبیوز می­شود، که این آنزیم­ها نقش مهمی در تغذیه و بیماری­زایی قارچ­ها بازی می­کنند. آنزیم­های کیتیناز کاربردهای مختلفی در کشاورزی، صنعت، پزشکی، داروسازی و همچنین برطرف کردن آلودگی آب دریاها و در نتیجه حفظ محیط زیست دارند (5). به­طور مثال از این آنزیم­ها می­توان در تهیه آفت­کش­ها و در صنایع­غذایی تولید­کننده محصولات دریایی، جهت تولید ترکیبات­مفید از پسماندها و مواد زاید حاوی کیتین حاصل از این­صنایع، استفاده نمود (4، 6، 7). تاکنون دانشمندان بسیاری از­جمله Smith وGrula  (1983)،Coudron  و همکاران (1984)، Havukkala و همکاران (1993)، Suresh و Chandrasekaran (1999) و Patidar و همکاران (2005) تولید کیتینازها را در گونه­های متفاوت، محیط­کشت­ها و مراحل متفاوت رشد قارچ Beauveria spp. مورد مطالعه قرار داده­اند (8-12). هدف از این تحقیق بررسی تولید آنزیم کیتیناز توسط گونه ایرانی قارچ بیمارگر حشرات B. bassiana و سنجش فعالیت آنزیم در محیط­کشت­ها و شرایط متفاوت مورد­بررسی می­باشد، بهینه­سازی آنزیم کیتیناز گامی بزرگ در جهت کمک به کشاورزی، صنعت و حفظ محیط زیست این مرز و بوم خواهد بود.

مواد و روش­ها

گونه قارچی و مواد استفاده شده

قارچ بیمارگر حشرات  Beauveria spp.از خاک منطقه مینودشت استان گلستان با موقعیت جغرافیایی  55˚ 17´ 25″ E)،(37˚ 10´ 21″ N در دانشگاه صنعتی شاهرود خالص­سازی شد، و پس از استخراج DNA به روش CTAB و تکثیر ناحیه ITS، با توجه به توالی­یابی ناحیه بارکدینگ ITS به عنوان گونه Beauveria bassiana شناسایی گردید. بعد از انجام بررسی­های بیماری­زایی گونه­های جداشده از منطقه بر­روی شپشه برنج Sitophilus oryzae)) گونه استفاده شده در این تحقیق (B. bassiana) در بین سایر گونه­ها قدرت بیماری­زایی بالاتری از خود نشان داد (داده­ها نشان داده نشده­اند). مواد شیمیایی و ترکیبات لازم برای تهیه محیط­کشت­ها از شرکت مرک (Merck) تهیه شدند.

شرایط کشت و جداسازی محیط کشت

کشت اولیه قارچ بر روی محیط کشت SDAY حاوی 10 گرم پپتون، 20 گرم دکستروز، 15 گرم آگار و 10 گرم عصاره مخمر انجام شد و پتری­دیش­ها در دمای ۲۸ درجه سانتی­گراد نگهداری شدند. هر دو هفته یک­بار عمل زیرکشت انجام شد. جهت کشت قارچ در محیط غوطه­ور، با استفاده از لوپ استریل از اسپورهای روی سطح پتری­دیش­های جامد برداشته شد و سوسپانسیون اسپور با فراوانی ۱۰^۷×۱ کنیدی/ میلی­لیتر تهیه شد، و به میزان یک میلی­لیتر در ۲۵۰ میلی­لیتر محیط کشت مایع تلقیح گردید.

محیط کشت­های متفاوت استفاده شده

از سه محیط کشت متفاوت، SDY با ترکیب (20 گرم دکستروز، 20 گرم پپتون، 10 گرم عصاره مخمر) + یک درصد وزنی/ حجمی کیتین کلوئیدی با دو اسیدیته متفاوت پنج و هفت، محیط کشت Pentecorve حاوی نمک­های (شش گرم سدیم نیترات، 52/0 گرم پتاسیم کلرید، 52/0 گرم منیزیم سولفات، 52/1 گرم پتاسیم دی­هیدروژن فسفات، 20 گرم دکستروز، 20 گرم پپتون، 10 گرم عصاره مخمر) + یک درصد وزنی/ حجمی کیتین کلوئیدی با دو اسیدیته متفاوت پنج و هفت، و محیط کشت  Pentecorveحاوی نمک­های فوق با­کمی تغییرات (شش گرم پتاسیم نیترات، 52/0 گرم پتاسیم کلرید، 52/0 گرم منیزیم سولفات، 52/1 گرم آمونیوم دی هیدروژن فسفات، 10 گرم دکستروز) + یک درصد وزنی/ حجمی کیتین کلوئیدی استفاده شد (13).

آماده سازی سوبسترا جهت بررسی فعالیت آنزیم کیتیناز

برای القا بیان آنزیم­های کیتینازی در محیط کشت و نیز به عنوان سوبسترا در سنجش فعالیت کیتینازی، از کیتین کلوئیدی استفاده گردید. کیتین کلوئیدی استفاده شده در این پژوهش طبق روش Roberts و  Selitrennikoff(1998) از کیتین حاصل از پوسته میگو تهیه شد (14). ماده خمیری شکل حاصل (کیتین کلوئیدی)، خشک و پودر گردید و از آن استفاده شد (شکل 1). یک گرم از کیتین کلوئیدی خشک شده به ۱۰۰ میلی­لیتر بافر فسفات با pH = 5/5 اضافه گردید و کیتین کلوئیدی یک درصد وزنی/ حجمی تهیه شده به عنوان سوبسترا در واکنش به کار رفت.

شکل 1- پودر کیتین کلوئیدی استخراج شده از پوسته میگو

سنجش فعالیت آنزیم کیتیناز بر روی محلول­رویی محیط­کشت­ها بعد از کشت قارچ در ارلن­های محیط کشت در دمای 28­درجه سانتی­گراد به مدت هفت روز به صورت غوطه ور با 160­rpm در دستگاه شیکر انکوباتور صورت گرفت. محلول پروتئینی محیط کشت قارچ با استفاده از کاغذ واتمن، قیف­بوخنر و پمپ خلاء از توده میسلیومی جدا شد و جهت سنجش آنزیمی استفاده گردید.

اندازه­گیری غلظت پروتئین به روش برادفورد

به منظور تعیین غلظت پروتئین، از روش برادفورد (1976) استفاده گردید (15). در این روش، غلظت پروتئین در نمونه با­استفاده از رنگ کوماسی برلیانت بلو ^[7]G-250 در طول موج 595 نانومتر، تعیین می­شود. با مقایسه جذب نمونه­های مجهول با منحنی استاندارد حاصل از غلظت­های معلوم پروتئین آلبومین سرم گاوی، مقدار پروتئین نمونه­های مجهول بدست می­آید. برای رسم منحنی استاندارد، محلول استاندارد پروتئین آلبومین سرم گاوی (BSA^[8])،  با غلظت mg/ml 1 تهیه شد. سپس به ترتیب مقادیر 1، 3، 5، 8، 10، 12 میکرولیتر از این­محلول را در 6 میکروتیوب ریخته و حجم نهایی آن­ها را با آب مقطر به 100 میکرولیتر می رسانیم. از یک ویال حاوی 100­میکرولیتر آب مقطر بدون آلبومین نیز، به­عنوان شاهد استفاده گردید. 1 میلی­لیتر معرف برادفورد به آن­ها افزوده و محتویات لوله­ها به خوبی مخلوط شد و پس از گذشت مدت­زمان 15­دقیقه، جذب نمونه­ها در طول موج 595 نانومتر خوانده شد. پس از ثبت جذب محلول­های استاندارد آلبومین سرم گاوی، منحنی استاندارد (جذب در برابر غلظت­های مختلف آلبومین سرم گاوی) رسم شد. به­منظور سنجش غلظت محلول پروتئینی محیط­های­کشت، به 100 میکرولیتر از محلول­رویی محیط­های کشت، 1 میلی لیتر محلول برادفورد افزوده شد. از یک ویال حاوی 100 میکرولیتر بافر نیز، به عنوان شاهد استفاده گردید. جذب نمونه­های مجهول در 595 نانومتر خوانده شد و با­استفاده از منحنی استاندارد مقدار پروتئین موجود در نمونه­های­مجهول، محاسبه گردید.

سنجش فعالیت آنزیم کیتیناز

سنجش آنزیم کیتینازی به روش رنگ­سنجی (Colorimetric) صورت گرفت. سنجش فعالیت آنزیم به­روش میلر (1959) انجام شد (16) که روش کار بدین صورت بود، در ابتدا محلول رویی محیط کشت توسط کاغذ وات من جدا گردید، 200 میکرو­لیتر از محلول رویی محیط کشت در­لوله آزمایشی ریخته شد و سپس 200 میکرو­لیتر کیتین­کلوئیدی یک درصد وزنی/ حجمی به آن اضافه شد. پس از آن لوله­ها در درای بس در دمای 37 درجه سانتی­گراد بدون شیکر انکوبه گردید. سپس به لوله­ها 400 میکرو­لیتر محلول 3 و 5- دی­نیتروسالیسلیک اسید (DNS) اضافه شد و به مدت 5­دقیقه در حمام آب جوش نگه­داشته شد. بعد از سرد شدن و سانتریفیوژ میکروتیوب­ها درg  × 8000 به مدت پنج دقیقه میزان جذب آنزیم، توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج ۵۴۰ نانومتر اندازه­گیری شد (شکل 2). در این آزمایش از تمام­ترکیبات مورد آزمایش به غیر از محلول رویی به عنوان شاهد استفاده شد.

تعیین مدت زمان سنجش فعالیت آنزیم

جهت تعیین زمان بهینه فعالیت آنزیم، 200 میکرو­لیتر از محلول رویی به عنوان نمونه آنزیمی به همراه 200 میکرو­لیتر از کیتین کلوئیدی یک درصد وزنی/ حجمی در درای­بس در­دمای 37 درجه سانتی­گراد به مدت­های 5/2، 5، 10، ۱۵، 30 دقیقه بدون شیکر با سه تکرار انکوبه گردید. پس از آن به لوله­ها 400 میکرو­لیتر محلول 3 و 5– دی­نیتروسالیسلیک اسید (DNS) اضافه شد و طبق روش توضیح داده شده سنجش فعالیت آنزیمی صورت گرفت.

شکل 2- سنجش آنزیم با روش دی­نیتروسالیسیلیک اسید. 4، شاهد و 1، 2 و 3 نمونه­های حاوی آنزیم هستند.

تعیین فعالیت آنزیم کیتیناز برحسب واحد آنزیمی

به منظور به دست آوردن فعالیت آنزیمی بر حسب واحد آنزیمی منحنی استاندارد (Standard curve) رسم شد. جهت کشیدن منحنی استاندارد غلظت­های متفاوت و متوالی صفر تا 12 میلی­مولار  N- استیل D- گلوکز آمین تهیه گردید. معادله خط منحنی به دست آمد و با استفاده از آن و میزان جذب نمونه­ها در 540 نانومتر و با استفاده از فرمول زیر واحدآنزیمی نمونه­ها محاسبه گردید.

واحد آنزیمی= N- استیل D- گلوکز آمین (میکرومول) /زمان سنجش

بر حسب تعریف یک واحد کیتیناز مقداری از آنزیم می­باشد که یک میکرومولار قند احیایی را در یک دقیقه آزاد می­کند زمانی­که  N- استیل D- گلوکز آمین به عنوان استاندارد مورد­استفاده قرار می­گیرد (16).

تعیین درصد سوبسترا بهینه فعالیت آنزیم

کیتین کلوئیدی با نسبت­های 1، 75/0، 5/0 و 25/0 درصد وزنی/ حجمی در بافر فسفات با 5/5 = pH  حل شد. سپس 200 میکرو­لیتر محلول رویی به عنوان نمونه آنزیمی به همراه 200 میکرو­لیتر سوبسترا با غلظت­های متفاوت در دمای 37­درجه­سانتی­گراد به مدت 15 دقیقه انکوبه شد و توسط معرف DNS، فعالیت آنزیم اندازه­گیری شد.

تعیین روز بهینه فعالیت آنزیم توسط قارچ

     بعد از کشت قارچ و رشد میسلیوم­ها از محلول رویی کشت­های سه، چهار، پنج، شش و هفت روزه به عنوان نمونه آنزیمی 200 میکرو­لیتر برداشته شد و به همراه 200 میکرو­لیتر از سوبسترای یک درصد وزنی/ حجمی در دمای 37 درجه سانتی­گراد به مدت 15 دقیقه انکوبه گردید و سنجش فعالیت آنزیم انجام شد.

تعیین دمای بهینه فعالیت آنزیم توسط قارچ

جهت تعیین دمای بهینه فعالیت آنزیم، 200 میکرو­لیتر از­محلول رویی به همراه 200 میکرو­لیتر از سوبسترای یک درصد با سه تکرار در دمای 30، 37، 45، 50، 55 درجه سانتی­گراد به­­مدت 15 دقیقه بدون شیکر در درای بس انکوبه گردید، و طبق روش توضیح داده شده سنجش فعالیت آنزیمی صورت گرفت.

نتایج و بحث

در این تحقیق پس از رسم منحنی استاندارد، غلظت آلبومین سرم گاوی در نمونه روی محور Xها و میزان جذب نمونه­ها روی محور Yها وارد گردید، معادله خط منحنی به دست آمد و با جای­گذاری مقادیر جذب محیط کشت­های مختلف در معادله غلظت نمونه آنزیمی در محیط کشت­های مختلف محاسبه گردید (جدول 1). مشاهده شد که غلظت ملغمه­ی ترشحی آنزیم گاهی در محیط کشت­های با 7 = pH و گاهی در محیط کشت­های با 5 = pH   بیش­تر است، و مقادیر جذب نشان می­دهد که بیش­ترین غلظت آنزیم مربوط به محیط کشت P(7) می­باشد.

میزان فعالیت آنزیم برحسب واحد آنزیم در دامنه زمانی 30-5/2 دقیقه با سوبسترای آنزیم (کیتین کلوئیدی یک درصد وزنی/ حجمی) در دمای 37 درجه سانتی­گراد مشاهده شد که در همه زمان­ها بیش­ترین میزان فعالیت کیتیناز در محیط­کشت P (7)می­باشد (جدول 2)، فعالیت کیتینازی تمامی محیط کشت­ها در بازه زمانی 5/2 تا 30 دقیقه کاهش یافته است. نتایج حاصل نشان می­دهد که در همه محیط کشت­ها، فعالیت کیتیناز طی زمان روند کاهشی داشته است، و براساس این­نتایج زمان بهینه انکوباته شدن سوبسترا و آنزیم 5/2 دقیقه می­باشد.

 بررسی اثر دو اسیدیته متفاوت پنج و هفت در محیط کشت روی فعالیت کیتیناز نشان داد که در سه نوع محیط کشت استفاده شده در pH هفت میزان فعالیت کیتیناز بیش­تر از محیط کشت با pH پنج است (جدول 1). pH­های محیط­واکنش طی سنجش فعالیت آنزیمی برای دو محیط کشت با ­pHهای هفت و پنج به ترتیب حدود شش و پنج اندازه­گیری شد (با استفاده از کاغذ ­pHسنج). بنابراین محیط کشت P (7) با 7= pH به عنوان محیط بهینه فعالیت آنزیم کیتیناز توسط قارچ Beauveria spp. معرفی می­گردد (شکل 3). Leopold و Samsinakova (1969) فعالیت آنزیم را در ­pHهای مختلف سنجش کردند، در آزمایش آن­ها فعالیت بهینه کیتیناز در pH حدود پنج مشاهده شد و دیده شد که در اسیدیته­های 5/3 و 7 آنزیم شدیدا غیر فعال می­شود (17).

جدول 1-غلظت آنزیم در محیط­کشت­های مختلف به روش بردفورد

جدول 2-میانگین فعالیت آنزیم محلول رویی تیمار شده با سوبسترا در دامنه زمانی 30-5/2 دقیقه بر حسب میکرومول بر دقیقه

شکل 3- واحد آنزیمی در دامنه زمانی 30-5/2 دقیقه در محیط­کشت­های مختلف. S(5): محیط­کشت SDY با 5 pH = ،S(7) : محیط­کشت SDY با 7 pH = ، P (5): محیط­کشت Pontecorvo با 5 pH = ،P (7): محیط­کشت Pontecorvo با 7 pH = ، P2 (5): محیط­کشت Pontecorvo با کمی تغییرات با 5 pH = ، P2 (5): محیط­کشت Pontecorvo با کمی تغییرات با 7  pH = را نشان می­دهد.

بررسی­ها نشان داد از بین درصدهای مختلف کیتین کلوئیدی، کیتین کلوئیدی 75/0 درصد بیش­ترین اثر مثبت روی فعالیت آنزیم کیتیناز داشته است. در تحقیقات انجام شده توسط  Leopoldو  Samsinakova(1969) تغییرات فعالیت آنزیم در مواجهه با 1 درصد کیتین کلوئیدی، به عنوان غلظت بهینه سوبسترا بر طبق کتاب Schoorl و همکاران (1929) بررسی گردید (17).

بررسی محیط­های کشت طراحی شده در روزهای مختلف نشان داد که پس از گذشت سه روز از زمان انکوبه شدن فعالیت آنزیمی بیش­ترین مقدار خود را دارا می­باشد (شکل 4). در این­آزمایش بیش­ترین میزان فعالیت کیتیناز در روزهای سه تا چهار اندازه­گیری شد. Leopold و Samsinakova (1969) بعد از اندازه­گیری میزان فعالیت کیتیناز در محیط کشت­های 12-2 روزه در قارچ B. bassiana مشاهده کردند که بیش­ترین فعالیت آنزیم در روزهای چهار تا پنج می­باشد (17). نتایج متفاوت حاصل از این آزمایش و آزمایشات مشابه احتمالا به­دلیل تفاوت شرایط کشت، روش سنجش فعالیت آنزیم و ایزوله قارچی مورد استفاده می­باشد.

شکل 4- تعیین بهترین مدت زمان انکوباسیون قارچ  Beauveria bassianaدر میزان فعالیت آنزیم کیتیناز. سه روز پس از کشت قارچ بر روی محیط بیشترین فعالیت آنزیم دیده می شود.

پس از بررسی دماهای مختلف، بهترین دمای واکنش جهت حصول بالاترین میزان فعالیت آنزیم کیتیناز قارچ Beauveria bassiana دمای 50 درجه سانتی­گراد تعیین شد. همچنین مشخص گردید آنزیم مورد بررسی در دمای 55 درجه سانتی­گراد دارای بیش از 90 درصد فعالیت حداکثر می­باشد. این آنزیم در دماهای 37 تا 45 درجه سانتی­گراد دارای 59 درصد فعالیت بیشینه می­باشد (شکل 5). در پژوهش Coudron و همکاران (1984) اثر دما روی فعالیت کیتیناز در قارچ  B. bassiana  اندازه­گیری شد نتایج تحقیق آنها نشان داد که، از دمای 40-10 درجه سانتی­گراد میزان فعالیت آنزیم با وجود افت و خیزها، روند افزایشی داشته است اما از دمای 55-40 فعالیت آنزیم روند کاهشی از خود نشان داد (18).

شکل 5- بررسی تاثیر دما بر میزان فعالیت آنزیم کیتیناز در قارچ Beauveria bassiana در حضور سوبسترای کیتین کلوئیدی، آنزیم در دمای 50 درجه سانتی­گراد دارای فعالیت بیشینه می­باشد.

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از حمایت­های جناب آقای دکتر سعید امین زاده، استادیار پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست­فناوری کمال تشکر و قدردانی را داریم.

منابع

1-      Kim, J. S. & Je, Y. H. 2010. A novel biopesticide production: attagel-mediated precipitation of chitinase from Beauveria bassiana SFB-205 supernatant for thermotolerance. Applied Microbiology and Biotechnology, VOL. 87, PP. 1639-1648.

2-      Pathan, A. A., Devi, K. U., Vogel, H. & Peineke, A. 2007. Analysis of differential gene expression in the generalist entomopathogenic fungus Beauveria bassiana (Bals.) Vuillemin grown on different insect cuticular extracts and synthetic medium through cDNA-AFLPs. Fungal Genetics and Biology, VOL. 44, PP. 1231-1241.

3-      Martin-Gil, F., Leal, J. A., Gomez-Miranda, B., Martin-Gil, J., Prieto, A. and Ramos-Sanchez, M. C. 1992. Low temperature thermal behaviour of chitins and chitin-glucans. Thermochimica Acta, VOL. 211, PP. 241-254.

4-      De León, A., Jimenez-islas, H., Gonzalez-cuevas, M. & Rosa, A. P. 2004. Analysis of the expression of the Trichoderma harzianum ech42 gene in two isogenic clones of Escherichia coli by surface response methodology. Process Biochemistry, VOL. 39, PP. 2173-2178.

5-      Raaijmakers, J. M., Leeman, M. & Oorschot, V. 1995. Dose-response relationships in biological control of Fusarium wilt of radish by Pseudomonas spp. Phytopathology, VOL. 85(10), PP. 1075-1081.

6-      Bierbaum, S., Nickel, R., Koch, A., Lau, S., Deichmann, K., Wahn, U., Superti-Furga, A. & Heinzmann, A. 2005. Polymorphisms and haplotypes of acid mammalian chitinase are associated with bronchial asthma. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, VOL. 172, PP. 1505-1512.

7-      Binod, P., Pusztahelyi, T., Nagy, V., Sandhya, C., Szakacs, G., Pocsi, I. & Pandey, A. 2005. Production and purification of extracellular chitinases fromPenicilliumaculeatum NRRL 2129 under solid-state fermentation. Enzyme and Microbial Technology, VOL. 36, PP. 880-887.

8-      Smith, R. J. & Grula, E. A. 1986. Chitinase is an inducible enzyme in Beauveria bassiana. Journal of Invertebrate Pathology, VOL. 42, PP. 319-326.

9-      Coudron, T. A., Kroha, M. J. & Ignoffo, C. M. 1984. Levels of chitinolytic activity during development of three entomopathogenic fungi. Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology, VOL. 3, PP. 339-348.

10-  Havukkala, I., Mitamura, C., Hara, S., Hirayae, K., Nishizawa, Y. & Hibi, T. 1993. Induction and Purification of Beauveria bassiana Chitinolytic Enzymes. Plos pathogens, VOL. 61, PP. 97-102.

11-  Suresh, P. V. & Chandrasekaran, M. 1998. Utilization of prawn waste for chitinase production by the marine fungus Beauveria bassiana by solid state fermentation. World Journal of Microbiology & Biotechnology, VOL.14, PP. 655-660.

12-  Patidar, P., Agrawal, D., Banerjee, T. & Patil, S. 2005. Chitinase production by Beauveria felina RD 101: optimization of parameters under solid substrate fermentation conditions. World Journal of Microbiology & Biotechnology, VOL. 21, PP. 93-95.

13-  13-Pontecorvo, G. 1953. The genetic of Aspergillus nidulans. Department of Genetics, the university, Glasgow Scotland.Advances in Genetics, VOL. 5, PP. 141–239.

14-  14-Roberts, W. K. & Selitrennikoff, C. P. 1998. Plant and bacterial chitinases differ in antifungal activity. Journal of General Microbiology, VOL. 134, PP. 426-428.

15-  Bradford, M. M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein -dye binding. Analytical Biochemistry, VOL. 72, PP. 248-252.

16-  Miller, G. L. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing suger. Analytical Chemistry, VOL. 3, PP. 426-428.

17-  17-Leopold, J. & Samsinakova, A. 1970. Quantitative estimation of chitinase and Severalother enzymes in the fungus Beuuveria bassiana. Journal of Invertebrate pathology, VOL. 15, PP. 34-42.

18-  18-Coudron, T. A., Kroha, M. J. & Ignoffo, C. M. 1984. Levels of chitinolytic activity during development of three entomopathogenic fungi. Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology, VOL. 3, PP. 339-348.