بررسی بقایای سم هپاتوتوکسین ناشی از سیانوباکترها در نمونه‌های آب با روش میکرو استخراج مایع-مایع پخشی

مستخرج از پایان نامه

علوم و تکنولوژی محیط زیست، دوره بیست و چهارم، شماره ده، دی ماه 1401 (44 -33)

بررسی بقایای سم هپاتوتوکسین ناشی از سیانوباکترها در نمونه­های آب با روش میکرو استخراج مایع-مایع پخشی

سهیلا رضائی تبار [1] ^*

rezaitabar.soheila@gmail.com

عباس اسماعیلی ساری [2]

نادر بهرامی­فر [3]

چکیده

زمینه و هدف: سموم هپاتوتوکسین (سموم کبدی) که توسط سیانوباکترها تولید می­شوند از سموم زیستی خطرناک هستند. با توجه به هزینه­بر و زمان­بر بودن فرآیند استخراج و اندازه­گیری آن­ها، هدف از تحقیق حاضر بررسی میزان کارائی شیوه استخراج سریع و جدید تحت عنوان میکرو استخراج مایع-مایع پخشی (DLLME) با استفاده از حلال­های آلی کلره در استخراج یکی از سموم هپاتوتوکسین بنام Microcystin-LR از نمونه­ی آب می­باشد. 

روش بررسی: در تحقیق حاضر ابتداء راندمان استخراج MC-LR با استفاده از روش رایج بکارگیری جاذب C18 بررسی شد. سپس راندمان استخراج با روش DLLME با بکارگیری نسبت­های مختلفی از حلال­های استخراج کننده­ی کلره (کلروفرم، دی کلرومتان، تتراکلریدکربن و تترا کلرواتیلن) و حلال­های پخش کننده (استون، متانول، اتانول و استونیتریل) مورد بررسی قرار گرفت.

یافته‌ها: نتایج تحقیق حاضر نشان داد که راندمان استخراج روش SPE با استفاده از جاذب C18، 102 % می­باشد. لازمه دستیابی به حداکثر راندمان استخراج در روش DLLME، تشکیل محیط ابری در نمونه (نشان دهنده­ی پخش­شدگی حلال استخراج کننده در فاز آبی) می­باشد که در این تحقیق، فقط در ترکیب استون و تتراکلرو اتیلن محیط ابری پایدار مشاهده شد. میزان بازیابی برای روش DLLME کمتر از 3% بدست آمد.

بحث و نتیجه­گیری: نتایج تحقیق حاضر نشان داد که اگرچه استفاده از حلال­های استخراج­گر کلره از درصد بازیابی قابل قبولی برای استخراج سم MC-LR از نمونه­های آبی برخوردار نمی­باشد ولی نظر به اینکه DLLME، روشی دوستدار محیط زیست، با مصرف کم حلال و مستقل از زمان می­باشد با بکارگیری حلال­های دیگری مانند حلال­های استخراج­گر یونی می­توان به نتایج دقیق و قابل قبول دست یافت.

واژه های کلیدی : سیانوباکتر، سموم هپاتوتوکسین، مایکروسیس­تین ال.آر، روش میکرو استخراج مایع-مایع پخشی.

Investigation of residue content of cyanobacterial hepatotoxin in water samples using DLLME method

Soheila Rezaitabar ^{[4] *}

rezaitabar.soheila@gmail.com

 Abbas Esmaili Sari ^[5]

Nader Bahramifar ^[6]

Abstract

Background and Objective: Hepatotoxins are dangerous biological toxins produced by cyanobacteria. Because of the high consumption of cost and time in the extraction and detection procedure of these toxins, the main aim of the present study is to investigate the performance of a new extraction technique, termed dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) in the extraction of one hepatotoxin with the name Microcystin LR from water samples, using chlorinated organic extraction solvents.

Material and Methodology: In the first stage, the efficiency of the common method (solid phase extraction) was investigated. Then the mixture of disperser solvents (acetone, ethanol, methanol, and acetonitrile) and extraction solvents (chloroform, dichloromethane, carbon tetrachloride and tetrachloroethylene) were used to investigate the efficiency of DLLME.

Findings: The results showed that the efficiency of SPE using a C18 cartridge was 102 %. For high efficiency of DLLME, a cloudy solution should be formed (fine particles of extraction solvent which are dispersed entirely into the aqueous phase). In the present study, only in a mixture of acetone and tetrachloroethylene (with different ratios), a stable cloudy solution was found. The best-observed efficiency was 3 % for DLLME.   

Discussion and Conclusion: The observations in this study suggest that although based on the obtained efficiency, the chlorinated organic solvents, could not be appropriate extraction solvents in MC-LR extraction, but the DLLME method using other solvents like Ionic liquid extraction solvents is a suitable technique for hepatotoxin extraction because of low consumption of cost, time and solvents in the extraction procedure.  

Keywords: Cyanobacteria, Hepatotoxins, Microcystin LR, DLLME.

مقدمه

برخی گونه­های سیانوباکتر (جلبک­های سبز آبی) مانند آنابنا، مایکروسیس­تیس، اوسیلاتوریا، نوستوک، آنابنوپسیس و ... قادر به تولید سمومی تحت عنوان سیانوتوکسین[7] می­باشند. وقتی دوره­ی زندگی سیانوباکترها به پایان می­رسد و یا در اثر استرس محیطی، غشاء آن­ها نسبت به حمله­ی میکروبی حساس شده؛ نهایتا سم موجود در سلول­های سیانوباکتر آزاد می­شود. همچنین استفاده از مواد شیمیایی جهت مبارزه با شکوفایی جلبکی (مانند سولفات مس) یا استفاده از مواد جهت هم­آوری در مراحل تصفیه­ی آب منجر به مرگ سیانوباکترها و افزایش سیانوتوکسین­های درون آب می­شود (1). سیانوتوکسین­ها از دیدگاه سم­شناسی و شیمیایی، جزء سموم طبیعی محسوب می­شوند (2). سیانوتوکسین­ها بر اساس ساختار شیمیائی به سه دسته­ی پپتیدهای حلقوی، آلکالوئیدها و لیپو­پلی­ساکاریدها تقسیم­بندی می­شوند (3). همچنین بر اساس تاثیر روی اندام هدف خود به سموم هپاتوتوکسین^[8] (سموم کبدی)، نوروتوکسین^[9] (سموم عصبی)، سیتوتوکسین^[10] (سموم سلول­های زنده) و درماتوتوکسین^[11] (سموم پوستی) تقسیم­بندی می­شوند (4). بیشترین شکوفایی سیانوباکترها در سراسر دنیا مربوط به سیانوباکترهای تولید کننده­ی سموم کبدی (هپاتوتوکسین­ها) می­باشد. سه دسته سموم کبدی بطور کلی عبارتند از: مایکروسیس­تین^[12]­ (پپتید حلقوی، حاوی 7 آمینواسید)، نودولارین^[13] (پپتید حلقوی، حاوی 5 آمینو اسید) و سیلیندروسپرموپسین^[14] (آلکالوئید) (1). از میان سموم کبدی، مایکروسیس­تین (MC) و نودولارین (NOD) رایج­تر هستند. بیشترین مشاهده و مطالعه نیز مربوط به مایکروسیس­تین­ها می­باشد. MCs پپتیدهای حلقوی هستند که به آسانی از غشاء سلولی عبور نمی­کنند (3)؛ ولی بطور فعال توسط مکانیسم حامل­های اسید صفرا منتقل می­شوند و سلول­های هپاتوسیت را مورد حمله قرار می­دهند. این سموم بازدارنده پروتئین فسفاتاز 1 و 2A بوده و منجر به تومور کبد می­شوند. نحوه اثر MCs در کبد بدین شرح است که  با توجه به اینکه پروتئن فسفاتاز (PPs) در کبد وظیفه­ی حذف فسفر از پروتئین؛ و پروتئین کینازس (PKs) وظیفه­ی اضافه کردن فسفر به پروتئین را دارد، MCs با ورود به بدن و در کبد از فعالیت PPs جلوگیری کرده و در نتیجه، فعالیت PKs منجر به Hyperphosphorylation می­شود. به دنبال این فرآیند، شبکه­ی سیتواسکلتون شامل  فیلامنت­ها و میکروتوبول­ها در کبد گسترش یافته و منجر به تجمع خون در بافت کبد و بدنبال آن تخریب سینوزوئیدی و شوک هموداینامیک و مرگ می­شود (5).  اثر MCs در بدن فقط منتهی به کبد نشده بلکه سیستم گوارشی و کلیه­ها را نیز تحت تاثیر قرار می­دهد (1).

 بطور کلی ساختار MCs پپتید تک حلقه­ای همراه با 7 آمینو اسید است. تا کنون بیش از 80 نوع ترکیب شاخه­دار از MCs شناسایی شده­ است (6). در میان MCs، Microcystin LR (MC-LR)، بیشترین مشاهده و گزارش را داشته است (2). دلیل نامگذاری آن، حضور آمینو اسید Leucine در جایگاه 2 و آمینو اسید Arginine در جایگاه 4 است. وزن مولکولی MC-LR، 995 گرم بر مول، میزان Lethal Dose 50 (در معرض­گذاری حاد) برای ماهیان بیش از 500 میکروگرم و برای پستاندارانی مانند موش 50 میکروگرم در کیلوگرم و فرمول شیمیایی آن C49H74N10O12 می­باشد (1) و (2). ساختار شیمیایی MC-LR در شکل 1 آمده است (7).

شکل 1- ساختار مولکولی MC-LR

Figure 1. Molecular structure of MC-LR

راه­های عمده قرار گیری انسان در مقابل MC-LR عبارتند از : 1. آشامیدن آب آلوده، 2. استنشاق قطرات یا تماس با موکوس بینی از طریق تماس تفریحی، 3. تماس پوستی با توکسین­ها از طریق استحمام یا فعالیت­های تفریحی مانند شنا کردن در آب حاوی بلوم و 4. مصرف ماهی و صدف آلوده و حتی گیاهانی که با آب آلوده آبیاری شده باشند (4). بارزترین حادثه مربوط به مسمومیت از طریق MC-LR مربوط به سال 1996 در برزیل است. از میان 131 بیمار دیالیزی، 100 نفر دچار مشکل کبدی شدند که 76 بیمار جان خود را از دست دادند. نتایج آزمایشات نشان داد که 52 نفر از 76 قربانی در معرض غلظت بالای MC-LR قرار گرفته­ و به همین دلیل جان خود را از دست دادند (8).

با توجه به سمیت این توکسین­ها، سازمان بهداشت جهانی حد مجازهائی را برای غلظت این توکسین­ها تعیین کرده است. حد مجاز WHO برای MC-LR در آب آشامیدنی 1 میکروگرم در لیتر و میزان جذب قابل تحمل روزانه (Tolerable Daily Intake) آن 04/0 میکرو گرم بر کیلوگرم وزن بدن می­باشد (3).

با توجه به اهمیت این سموم در سلامت عمومی، مطالعات فراوانی در سراسر دنیا به بررسی غلظت MC-LR در آب آشامیدنی و محدوده­های آب طبیعی مثل رودخانه­ها، تالاب­ها و ... پرداخته­اند که از آن جمله می­توان به می­توان به تحقیقات Lawton و همکاران (9)، Lahti و همکاران (10)، Hummert و همکاران (11)، Ame و همکاران (12)، Zhang و همکاران (13)، Vieria و همکاران (14)، Messineo و همکاران (15)، Li‌ و همکاران (16)، Lawton و همکاران (17)، Triantis و همکاران (18)، Shan و همکاران (19) اشاره کرد.

روش­های متعددی برای اندازه­گیری این سموم در آب آشامیدنی وجود دارد. از جمله این روش­ها می­توان به روش کیت ارزیابی ایمنی  (Immunoassay ELIZA kit ) و روش ارزیابی پروتئین فسفاتاز اشاره کرد که حد تشخیص بالائی دارند و برای غربالگری مناسب هستند (2). ولی روش­های کروماتوگرافی مانند دستگاه­های LC/UV، LC/MS و همچنین GC/MS از حد تشخیص و دقت بسیار خوبی برخوردار هستند. پیش­نیاز استفاده از دستگاه­های کروماتوگرافی آماده­سازی نمونه و استخراج توکسین مورد نظر با استفاده از جاذب می­باشد. از رایج­ترین جاذب­ها می­توان به جاذب C18 اشاره کرد (20). انتخاب روش تعیین میزان سیانوتوکسین بستگی به پارامترهائی مانند در دسترس بودن امکانات، نیروی متخصص و میزان دقت داده­های بدست آمده می­باشد. اکثر روش­های عنوان شده جهت استخراج سیانوتوکسین­ها از آب، نیازمند حجم نمونه، زمان و هزینه­ی بالا هستند.

روش Dispersive Liquid Liquid Micro Extraction که برای اولین بار در دنیا توسط Assadi و همکاران در سال 2006 ابداع شد (21) بر اساس انتقال آنالیت مورد نظر از نمونه­ی مایع به یک حلال امتزاج ناپذیر با آب استوار می­باشد. رسیدن سریع به حالت تعادل و مستقل از زمان بودن، مهم­ترین مزیت این روش می­باشد. این روش شامل دو مرحله­ی اصلی است: 1. تزریق ترکیب مناسبی از حلال استخراج کننده و پخش کننده درون نمونه­ی محلول حاوی آنالیت: در این مرحله حلال استخراج کننده بصورت قطره­های کوچک بوسیله­ی حلال پخش کننده وارد فاز حاوی آنالیت شده و آنالیت، درون حلال استخراج کننده تغلیظ می­شود 2. سانتریفیوژ کردن محلول ابری و سپس قرائت غلظت آنالیت مورد نظر موجود در فاز ته­نشین شده با دستگاه مناسب. مهم­ترین پارامتر در کارایی روش DLLME استفاده از حلال استخراج کننده و پخش کننده­ی مناسب با حجم مناسب می­باشد. حلال­های استفاده شده بر اساس بالاتر بودن چگالی نسبت به آب، قابلیت استخراج­گری آنالیت مورد نظر و رفتار کروماتوگرافی مناسب انتخاب می­شوند (22). DLLME تکنیکی محبوب و دوستدار محیط زیست محسوب می­شود؛ زیرا روشی سریع، ارزان، ساده با فاکتور غنی­سازی بالا و با حجم کم حلال مصرفی می­باشد. تا کنون مطالعات زیادی در زمینه­ی استخراج آنالیت­های آلی از فاز مایع با استفاده از این روش انجام شده است (23)، (24)، (25) و (26). اما تنها یک تحقیق در دنیا در زمینه­ی استخراج سموم سیانوتوکسین از نمونه­های آبی با استفاده از روش DLLME به چاپ رسیده است که مربوط به مطالعه­ی Yu و همکاران در  سال 2015 می­باشد (27). در تحقیق مذکور از محلول­های یونی بعنوان حلال استخراج کننده استفاده شده است. حلال­هائی بعنوان حلال  استخراج کننده استفاده می­شوند که امتزاج ناپذیر (Immiscible) با آب هستند و معمولا از آب سنگین­تر هستند. تحقیق حاضر اولین مطالعه روی سموم هپاتوتوکسین در ایران می­باشد. تا کنون هیچ گزارشی از غلظت سیانوتوکسین­ها در آب آشامیدنی یا محیط­های طبیعی ثبت نشده است. لذا هدف از تحقیق حاضر بررسی کارائی روش DLLME در استخراج سم MC-LR از نمونه­های آب با استفاده از حلال­های استخراج­گر کلره می­باشد.

2- روش بررسی

2-1 روش SPE

در این روش از جاذب C18 برای جذب آنالیت مورد نظر و سپس واجذب آن با حلال مشخصی استفاده می­شود. ابتداء کارتریج 500 میلی­گرمی C18 (Inopak)، با 10 میلی­لیتر متانول و 10 میلی­لیتر استیک اسید 5 % کاندیشن شده، سپس 250 میلی­لیتر نمونه­ی آب دیونیزه که با سم MC-LR اسپایک شده بود با جریان آهسته با بکارگیری پمپ خلاء از جاذب عبور داده شد. پس از جذب آنالیت روی جاذب، با استفاده از 3 میلی­لیتر متانول خالص واجذب گردید. سپس با استفاده از گاز نیتروژن حلال پرانی شده و مجدد با 50 میکرولیتر متانول به حجم رسانده شد و آماده تزریق به دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارائی بالا (High Performance Liquid Chromatography) گردید. شکل 2 نمایانگر نحوه­ی استفاده از جاذب در استخراج MC-LR از نمونه­ی آب دیونیزه اسپایک شده با سم می­باشد.

شکل 2- استفاده از جاذب اکتا دسیل سیلان (C18) در روش استخراج SPE

Figure 2. Using octadecil-silane cartridge (C18) in SPE method

2-2 روش DLLME

روش­های رایج استخراج MC-LR از نمونه­های آب، با اسیدی کردن نمونه­ی آبی انجام می­گیرد (28) و (29). در تحقیق حاضر نیز استخراج MC-LR هم در محیط آبی خنثی و هم محیط آبی اسیدی بررسی گردید. از استیک اسید بمنظور اسیدی کردن نمونه­ی آب استفاده شد. 5 میلی­لیتر نمونه­ی آب دیونیزه درون لوله­های سانتریفیوژ ریخته شد. سپس حجم مشخصی از استاندارد MC-LR به آب اضافه شد. در مرحله­ی بعد ترکیب حلال­های مختلفی بعنوان حلال استخراج و پخش کننده به نمونه اضافه گردید (سرعت تزریق ترکیب حلال­ها به نمونه در ابری شدن محیط بسیار تاثیر گذار است). در تست­های جداگانه از استون، متانول، اتانول و استونیتریل بعنوان حلال پخش کننده و از کلروفرم، دی کلرومتان، تتراکلریدکربن  و تترا کلرواتیلن  بعنوان حلال استخراج کننده استفاده شد. نسبت­های بکار گرفته شده برای حلال­های استخراج کننده از 35 میکرولیتر تا 100 میکرولیتر و نسبت حلال پخش کننده از 400 میکرولیتر تا 965 میکرولیتر تست گردید. تعیین این نسبت­ها بر اساس تجربیات بدست آمده از مقالات مختلف انجام گرفت. برای مثال، 350 میکرولیتر C2CL4 با استون به حجم 10 میلی­لیتر رسید. سپس یک میلی­لیتر از این ترکیب به 5 میلی­لیتر استاندارد ng L 50 MC-LR تزریق شد و بعد از تشکیل محیط ابری، لوله­های سانتریفیوژ بمدت 15 دقیقه در دور rpm 2000 (دستگاه سانتریفیوژ Hermle مدل Z36HK) قرار گرفتند. در روش DLLME با توجه به اینکه حجم حلال استخراج کننده بسیار کم و معمولا در حد 50 تا 100 میکرولیتر می­باشد، لذا لوله سانتریفیوژ بکار گرفته شده باید ته مخروطی نوک تیز باشد که بتوان حلال استخراج کننده را براحتی با سرنگ از انتهای لوله جمع کرد. سپس حلال استخراج کننده جمع شده در انتهای لوله­ی سانتریفیوژ با سرنگ برداشته شد و با نیتروژن حلال پرانی شد و با متانول به حجم 50 میکرولیتر رسید و سپس به دستگاه HPLC (ساخت شرکت Shimadzu) تزریق گردید. در برخی موارد محیط ابری تشکیل و در برخی نسبت­ها تشکیل نشد. بمنظور بررسی راندمان استخراج، هر دو حالت به دستگاه تزریق شدند. همچنین حلال­های استخراج کننده بدون حلال پخش کننده نیز امتحان شدند. بمنظور بررسی میزان کارائی استخراج، سطح زیر پیک بدست آمده از نمونه­ی مورد نظر با سطح زیر پیک مورد انتظار مقایسه گردید و راندمان استخراج بصورت درصد محاسبه شد.

2-3 استاندارد سم MC-LR

ماده استاندارد MC-LR با غلظت 50 میکروگرم بمنظور کالیبراسیون دستگاه HPLC از شرکت Enzo life sciences آمریکا خریداری گردید. سپس در متانول خالص (HPLC grade) حل شده و غلظت­های مختلفی از آن بمنظور کالیبراسیون دستگاه و اسپایک به نمونه­های آب دیونیزه بمنظور بررسی کارائی روش SPE و DLLME تهیه شد.

2-4 تجزیه دستگاهی

بمنظور تعیین غلظت MC-LR در نمونه­های استخراج شده، دستگاه HPLC ساخت شرکت Shimadzu با آون CTO-10 Ac VP (دمای 20 درجه سانتی­گراد) و مجهز به آشکار ساز ماوراء بنفش مرئی (UV-Vis) (SPD-10A vp)، سیستم گاز زدا، لوپ تزریق با حجم 20 میکرولیتر و ستون تجزیه­ای Nova-Pack C18 (با ابعاد 150 * 9/3 میلی­متر و قطر ذرات 4 میکرومتر) استفاده شد. از مخلوط سه تائی متانول: استونیتریل: تری فلوئورو استیک اسید 05/0 % به نسبت 30: 25: 45 بعنوان فاز متحرک استفاده گردید. نرخ جریان فاز متحرک از ستون 1 میلی­لیتر بر دقیقه بود. بیشترین جذب MC-LR در طول موج 239 نانومتر می­باشد که دستگاه HPLC نیز در این طول موج تنظیم گردید.

3- یافته­ها

بمنظور تعیین غلظت سم MC-LR در نمونه­ها، ابتداء دستگاه HPLC با استفاده از غلظت­های مختلف سم کالیبره گردید و منحنی و معادله­ی کالیبراسیون آن بصورت شکل 3 بدست آمد.

همچنین حد تشخیص (Limit Of Detection) دستگاه در اندازه­گیری این سم در نمونه­های آب 18/0 میکرو گرم بر لیتر بدست آمد. نمونه­ای از کروماتوگرام سم MC-LR حاصل از دستگاه HPLC در شکل 4 نشان داده شده است.

شکل 3- منحنی کالیبراسیون MC-LR

Figure 3. Calibration curve of MC-LR

شکل 4- کروماتوگرام دستگاه HPLC، حاصل از شناسائی سم MC-LR

Figure 4. HPLC chromatogram of MC-LR standard

نتایج تحقیق حاضر نشان داد میزان راندمان استخراج MC-LR با استفاده از جاذب C18 102 % می­باشد. نتایج تحقیق حاضر نشان داد که استفاده از نسبت­های مختلف حلال­های استخراج و پخش کننده نتایج متفاوتی را در تشکیل محیط ابری در بر دارد. بدان معنا که در برخی موارد محیط ابری پایدار، در برخی موارد محیط ابری نیمه پایدار و در برخی دیگر محیط ابری ناپایدار تشکیل می­شود. در جدول 1 نتایج حاصل از بکارگیری نسبت­های مختلف حلال­های استخراج و پخش کننده و ایجاد یا عدم ایجاد محیط ابری ارائه شده است.

جدول 1- نتایج حاصل از بکارگیری نسبت­های مختلف حلال­های استخراج­کننده (از 35 تا 100 میکرولیتر) و پخش کننده (از 400 تا 900 میکرولتر) در تشکیل محیط ابری

Table 1. The results of using different ratio of extraction solvents (35 to 100 µl) and disperser solvents (400 to 900 µl) in formation of cloudy solution.

- عدم تشکیل محیط ابری، ± تشکیل محیط ابری در برخی نسبت­ها، # محیط ابری نیمه پایدار، + محیط ابری پایدار

 بهترین حالت محیط ابری پایدار در ترکیب تترا کلرو اتیلن و استون با نسبت­های 35 به 965 میکرولیتر، 100 به 750 میکرولیتر و 50 به 800 میکرولیتر مشاهده شد. نمونه­ای از محیط ابری ایجاد شده در شکل 5 آورده شده است.

شکل 5- تشکیل محیط ابری در نمونه

Figure 5. Formation of sample cloudy solution

 همچنین بمنظور بررسی تاثیر حلال پخش کننده بر میزان کارائی، استخراج بدون استفاده از حلال پخش کننده نیز انجام گرفت که در این مورد از حمام اولتراسونیک جهت کمک به پخش شدگی حلال استخراج کننده در نمونه استفاده شد. در تمامی موارد بررسی شده، اعم از محیط ابری ایجاد شده یا نشده، محیط اسیدی یا خنثی نمونه و همچنین استفاده از حلال پخش کننده یا عدم استفاده آن، در صد بازیابی سم MC-LR و راندمان استخراج کمترا از 3% مشاهده شد. به  بعبارتی نتایج تحقیق حاضر نشان داد که حلال­های کلره جهت استخراج سموم کبدی از نمونه­های آبی با روش DLLME مناسب نیستند. این مطلب بیانگر آن است که حلال­های کلره قادر به برقراری پیوند قوی با سم MC-LR و جداسازی آن از فاز آبی و ته نشست آن در فاز آلی نیستند.

بحث و نتیجه­گیری

بر اساس نتایج تحقیق حاضر، استفاده از حلال­های کلره برای استخراج سم MC-LR از نمونه­های آب مناسب نمی­باشد ولی این بدان معنا نیست که روش DLLME نیز برای استخراج سیانوتوکسین­ها از نمونه­های آب مناسب نباشد. برای مثال Yu و همکاران (27)، بمنظور بررسی راندمان استخراج MC-LR و MC-RR از نمونه­های آب آشامیدنی و آب رودخانه، از حلال­های استخراج­گر یونی زیر استفاده کردند.

1: 1-butyl-3-methylimidazolium chloride ([BMIM][Cl])

2: 1-(6-hydroxyethyl)-3-methylimidazolium chloride ([HeOHMIM][Cl])

3: 1-benzyl-3-(2- hydroxyethyl) imidazolium bromide ([BeEOHIM][Br])

از میان حلال­های استخراج­گر بکار گرفته شده، [BeEOHIM][Br] به دلیل دارا بودن بخش آروماتیکی و گروه کربوکسیل بهترین راندمان استخراج را نشان داد. راندمان استخراج در آب آشامیدنی در دامنه­ی 45 تا 109% و در آب رودخانه بین 46 تا 103% گزارش گردید. بنابراین با نتایج بدست آمده از تحقیق حاضر و تحقیق Yu و همکاران (27) می­توان استنباط کرد که در استخراج سموم کبدی از نمونه­های آبی با روش DLLME، استفاده از محلول­های یونی بعنوان حلال استخراج­گر راندمان استخراج بسیار بهتری را نسبت به حلال­های کلره دارند. همانگونه که اشاره گردید روش رایج استخراج این سموم از آب روش SPE می­باشد. اگرچه راندمان استخراج این روش قابل قبول است ولی برخی پارامترهائی که در مناسب بودن یک تکنیک دخیل هستند را دارا نمی­باشد. برای مثال روش SPE، به حجم بیشتری از نمونه (حداقل 250 میلی­لیتر) نیازمند است و این در حالی است که در روش DLLME فقط با وجود 5 میلی­لیتر از نمونه می­توان به نتیجه مورد انتظار دست یافت. از طرف دیگر در روش SPE، قبل از عبور نمونه از جاذب، باید جاذب را با سرعت کم و جریان کم حلال کاندیشن کرد و در هنگام عبور نمونه نیز نرخ جریان و عبور نمونه از جاذب باید بقدری کم باشد تا فرصت جذب شدن آنالیت بر روی جاذب و بعد از آن نیز فرصت واجذب فراهم گردد. بنابراین زمان­بر بودن روش SPE نسبت به روش DLLME از دیگر معایب آن است. این در حالی است که در روش DLLME با تزریق سریع مخلوط حلال استخراج­گر و پخش کننده به نمونه مورد نظر و تشکیل محیط ابری، و پس از سانتریفیوژ، می­توان آنالیت مورد نظر را از نمونه جدا کرده و به دستگاه تزریق نمود. مزیت مهم دیگر روش DLLME نسبت به روش SPE آن است که به میزان کمی از حلال نیازمند است. یعنی با حجم یک میلی­لیتر از مخلوط حلال استخراج­گر و پخش کننده می­توان آنالیت مورد نظر را استخراج کرد در صورتیکه در روش SPE علاوه بر کاندیشن کردن جاذب، بمنظور واجذب آنالیت مورد نظر نیز، حلال مورد نیاز است. با توجه به مزایای روش DLLME، مطالعات فراوانی در زمینه­ی  بررسی کارائی روش DLLME در استخراج آلاینده­های آلی از ماتریس مایع صورت گرفته است. برای مثالRezaei  و همکاران (26) به استخراج ده ترکیب Poly Chlorinate Biphenyls از نمونه­های آب با استفاده از استون و کلروبنزن بعنوان حلال پخش کننده و استخراج کننده پرداختند. نتایج تحقیق آن­ها نشان داد درصد بازیابی این روش در استخراج ترکیبات PCB از نمونه­های آب چاه، رودخانه و دریا بترتیب 92 تا 114%، 97 تا 102%  و 96 تا 103% می­باشد. Liang و همکاران (30) به بررسی میزان فتالات استرها (DMP، DEP و DnBP) در نمونه­های آب دریاچه و آب آشامیدنی با استفاده از حلال پخش کننده استونیتریل و حلال استخراج کننده تترا کلرید کربن پرداختند. نتایج تحقیق آن­ها نشان داد میزان بازیابی برای این ترکیبات از 84 تا 113% بود. در تحقیقی دیگر Berijani و همکاران (23) به استخراج حشره­کش­های ارگانوفسفره از نمونه­های اب با استفاده از روش DLLME و بکارگیری استون و کلروبنزن بعنوان حلال پخش کننده و استخراج کننده پرداختند. نتایج تحقیق آن­ها نشان داد درصد بازیابی این حشره­کش­ها با استفاده از این روش 9/78 تا 107 % می­باشد.      

تشکر و قدردانی

این مقاله حاصل بخشی از پایان­نامه­ی دکتری با عنوان ارزیابی میزان پتانسیل تهدید سلامتی و انباشتگی زیستی Microcystin LR در آب و ماهی می­باشد که با حمایت­های مالی دانشگاه تربیت مدرس اجرا شده است.

References

1. Zurawell, R.W, Chen, H., Burke, J.M, Prepas, E.E. 2005. Hepatotoxic cyanobacteria: A review of the biological importance of microcystins in freshwater environments. Journal of Toxicology and Environmental Health.8(1), 1–37.
2. 1999. Toxic Cyanobacteria in Water: A guide to their public health consequences, monitoring and management. I. C. a. J. Bartram (Ed). 400 p.
3. Cyanobacterial toxins: Microcystin-LR in drinking-water. 1998;2(2):14p.
4. Kaushik,, Balasubramanian, R. 2013. Methods and approaches used for detection of cyanotoxins in environmental samples: A Review. Critical Reviews in Environmental Science and Technology. 43(13), 1349-1383.5.
5. Ott, J.L., Carmichael, W.W. 2006. LC/ESI/MS method development for the analysis of hepatotoxic cyclic peptide microcystins in animal tissues. Toxicon. 47(7), 734-74.
6. Maske, S.S., Sangolkar, L.N., Chakrabarti, T. 2010. Temporal variation in density and diversity of cyanobacteria and cyanotoxins in lakes at Nagpur (Maharashtra state), India. Environmental Monitoring and Assessment.169(1-4):299–308S.
7. Merel, S., LeBot, b., Clement, M., Seux, R., Thomas, O. 2009. Ms Identification of microcystin-LR chlorination by-products. Chemosphere.74(6), 832-839.
8. Yuan, M., Carmichael, W.W., Hilborn, E.D. 2006. Microcystin analysis in human sera and liver from human fatalities in Caruaru, Brazil 1996. Toxicon. 48(6), 627-6409.
9. Lawton, L.A., Edwards, Ch., Codd, GA. 1994. Extraction and high-performance liquid chromatographic method for the determination of microcystins in raw and treated waters. Analyst. 119(7), 1525-1530.
10. Lahti, K., Rapala, J., Färdig, M., Niemelä, M., Sivonen, K. 1997. Persistence of cyanobacterial hepatotoxin, microcystin-LR in particulate material and dissolved in lake water. Water Research. 31(5), 1005-1012.
11. Hummert, C., Reichelt M, Weib, J., Liebert, H.P., Luckas, B. 2001. Identification of microcystins in cyanobacteria from the Bleiloch former drinking-water reservoir (Thuringia, Germany). Chemosphere.44(7), 1581-1588.
12. Ame, M.V., Pilar, Diaz, M.d., Wunderlin, D.A. 2003. Occurance of toxic cyanobacterial blooms in San Roque reservoir (Cordoba, Argentina): A field and chemometric study. Environmental Toxicology. 18(3), 192-201.
13. Zhang, L., Xie, P., Yang, Zh. 2004. Determination of microcystin-LR in surface water using high-performance liquid chromatography/tandem electrospray ionization mass detector. Talanta. 62(1), 193–200.
14. Vieira, J.M.d.S., Azevedo, M.T.d.P., Azevedo, S.M.F.d.O., Honda, R.Y., Corrêa, B. 2005. Toxic cyanobacteria and microcystin concentrations in a public water supply reservoir in the Brazilian Amazonia region. Toxicon. 45(7), 901-909.
15. Messineo, V., Bogialli, S., Melchiorre, S., Sechi, N., Lugliè, A., Casiddu, P., 2009. Cyanobacterial toxins in Italian freshwaters. Limnologica- Ecology and Management of Inland Waters. 39(2), 95-106.
16. Li, Z., Yu, J., Yang, M., Zhang, J., Burch, M.D., Han, W. 2010. Cyanobacterial population and harmful metabolites dynamics during a bloom in Yanghe reservoir, North China. Harmful Algae. 9(5), 481-488.
17. Lawton, L.A., Chambers, H., Edwards, Ch., Nwaopara, A.A., Healy, M. 2010. Rapid detection of microcystins in cells and water. Toxin. 55(5), 973–978.
18. Triantis, T., Tsimeli, K., Kaloudis, T., Thanassoulias, N., Lytras, E., Hiskia, A. 2010. Development of an integrated laboratory system for the monitoring of cyanotoxins in surface and drinking waters. Toxicon. 5(5), 979-989.
19. Shan, Y., Shi, X., Dou, A., Zou, C., He, H., Yang, Q., Zhao, S., Lu, X., Xu, G. 2011. A fully automated system with on-line micro solid-phase extraction combined with capillary liquid chromatography–tandem mass spectrometry for high throughput analysis of microcystins and nodularin-R in tap water and lake water. Journal of Chromatography A. 1218(13), 1743-1748.
20. 2008. Guidelines for drinking water quality. 3^rd ed. Vol 1. Geneva.
21. Rezaee, M., Assadi, Y., Hosseini, M.R., Aghaee, E., Ahmadi, F., Berijani, S. 2006. Determination of organic compounds in water using dispersive liquid-liquid microextraction. Journal of Chromatography A. 1116(1-2), 1-9.
22. Rezaee, M., Yamini, Y., Faraji, M. 2010. Evolution of dispersive liquid–liquid microextraction method, Journal of Chromatography A. 1217(16), 2342-2357.
23. Berijani, S., Assadi, Y., Anbia, M., Milani. Hosseini, M.R., Aghaee, E. 2006. Dispersive liquid-liquid microextraction combined with gas chromatography-flame photometric detection. Very simple, rapid and sensitive method for the determination of organophosphorus pesticides in water. Journal of Chromatography A. 1123(1), 1–9.
24. Farahani, H., Norouzi, P., Dinarvand, R., Ganjali, M.R. 2007. Development of dispersive liquid-liquid microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry as a simple, rapid and highly sensitive method for the determination of phthalate esters in water samples. Journal of Chromatography A.1172(2), 105–112.
25. Nuhu, A.a., Basheer, C., Saad, B. 2011. Liquid-phase and dispersive liquid-liquid microextraction techniques with derivatization: Recent applications in bioanalysis. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879(17-18), 1180–1188.
26. Rezaei, F., Bidari, A., Birjandi, A.P., Milani, Hosseini, M.R., Assadi, Y. 2008. Development of a dispersive liquid-liquid microextraction method for the determination of polychlorinated biphenyls in water. Journal of Hazardous Materials. 158(2-3), 621–627.
27. Yu, H., Clark, K.D., Anderson, J.L. 2015. Rapid and sensitive analysis of microcystins using ionic liquid-based in situ dispersive liquid – liquid microextraction. Journal of Chromatography A. 1406, 10–18.
28. Amé, M.V., Galanti, L.N., Menone, M.L., Gerpe, M.S., Moreno, V.J., Wunderlin, D.A. 2010. Microcystin–LR, –RR, –YR and –LA in water samples and fishes from a shallow lake in Argentina. Harmful Algae. 9(1), 66-73.
29. Cazenave, J., Wunderlin, D.A., Bistoni, M.d.l.Á., Amé, M.V., Krause. E., Pflugmacher. S., Wiegand, C. 2005. Uptake, tissue distribution and accumulation of microcystin-RR in Corydoras paleatus, Jenynsia multidentata and Odontesthes bonariensis: A field and laboratory study, Aquatic Toxicology.;75(2):178-190.
30. Liang, P., Xu, J., Li, Q. 2008. Application of dispersive liquid liquid microextraction and high performance liquid chromatography for the determination of three phthalate esters in water samples. Analytica Chimica Acta. 609(1), 53-58.

1- دکتری آلودگی محیط زیست، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده منابع طبیعی و علوم دریائی، نور، مازندران، ایران. ^* (مسوول مکاتبات)

2- استاد گروه محیط زیست، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده منابع طبیعی و علوم دریائی، نور، مازندران، ایران.

3- استادیار گروه محیط زیست، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده منابع طبیعی و علوم دریائی، نور، مازندران، ایران.

1- Ph. D in Environmental pollution, Faculty of Natural Resources and Marine Science, Tarbiat Modares University, Mazandaran, Iran. *(Corresponding Author)

2- Professor, Faculty of Natural Resources and Marine Science, Tarbiat Modares University, Noor, Mazandaran, Iran.

3- Assistant Professor, Faculty of Natural Resources and Marine Science, Tarbiat Modares University, Noor, Mazandaran, Iran.

1- Cyanotoxin

[8]- Hepatotoxin

[9]- Neurotoxin

[10]- Cytotoxin

[11]- Dermatotoxin

[12]- Microcystin

[13]- Nodularin

[14]- Cylindrospermopsin