ارتباط بین در معرض‌گذاری آزمایشگاهی به نفت خام و پاسخ‌های آنتی‌‌اکسیدانی بارناکل‌های Tetraclita rufotincta

علوم و تکنولوژی محیط زیست ، دوره هفدهم، شماره یک ،  بهار 94

ارتباط بین در معرض‌گذاری آزمایشگاهی به نفت خام و پاسخ‌های آنتی‌‌اکسیدانی بارناکل‌های  Tetraclita rufotincta

مژگان امتیازجو [1]

لیدا سلیمی [2]

مجید زینلی[3]

بهار شهابی[4]

مریم قاسم‌پورملکی[5] ^*

Maryam_ghasempoor@yahoo.com

چکیده

زمینه و هدف: امروزه اثرات مخرب آلودگی‌های نفتی حاصل از منابع مختلف در آب‌ها و نیز آب‌زیان شناسایی و مشخص گردیده است. به‌منظور بررسی اثرات نفت خام در غلظت‌های متفاوت، بر تغییرات سطح آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی(کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز) در بارناکل Tetraclita rufotincta و امکان معرفی این آنزیم‌ها به‌عنوان بیومارکرهای زیستی.

روش: بارناکل‌های  Tetraclita rufotincta جمع‌آوری شده از منطقه نفتی بهرگان در معرض دوزهای نفتی ppb 250، 125، 5/62، 25/31، 625/15وppb3 به‌عنوان شاهد قرار گرفتند. در بازه‌های زمانی 24، 48، 72و 96 ساعت، به‌طور متوسط تعداد 15 بارناکل از آکواریوم‌ها خارج، و برای تعیین سنجش میزان آنزیم‌های کاتالاز(CAT) و سوپراکسید دیسموتاز(SOD) مورد آزمایش قرار گرفتند.

نتایج: این مطالعه نشان داد که در آکواریوم1، با غلظت ppb3 در طی دوره‌های زمانی 24، 48، 72و 96 ساعت فعالیت آنزیم SOD  به‌ترتیب 98/128، 04/30، 8/75،U/ml/mg protein  05/62 می‌باشد. در آکواریوم2 و 3، با غلظتppb 625/15 و ppb 25/31 در طی دوره‌های زمانی ذکر شده فعالیت آنزیم SOD  به‌ترتیب 45/104، 95/74، 57/13،  U/ml/mg protein109 و 96/69، 56/61، 5/60، U/ml/mg protein 46/86  ثبت گردید. در آکواریوم 4 و 5، با غلظتppb 5/62 و ppb125 در طی دوره‌های زمانی یاد شده فعالیت آنزیم SOD  به‌ترتیب 79/98، 9/193، 75/42، U/ml/mg protein 77/124 و 22/69، 08/40، 86/ 81، U/ml/mg protein 95/59 ثبت گردید. در آکواریوم6، با غلظت ppb250 در طی دوره‌های زمانی مذکور فعالیت آنزیم SOD  به‌ترتیب11/62،  1/87، 71/20، U/ml/mg protein 47/93 ثبت گردید.

نتایج همچنین نشان داد که در آکواریوم1، با غلظت ppb3 در طی دوره‌های زمانی 24، 48، 72و 96 ساعت فعالیت آنزیم CAT به‌ترتیب 29/13، 31/15، 5/15، nmol/min/ml/mg protein 25/16 می‌باشد. در آکواریوم2 و 3، با غلظتppb 625/15 و ppb 25/31 در طی دوره‌های زمانی یاد شده فعالیت آنزیم CAT به‌ترتیب 03/13، 74/16، 65/13،  nmol/min/ml/mg protein 61/13 و 46/11، 54/16، 7/15، nmol/min/ml/mg protein 58/13 ثبت گردید. در آکواریوم4 و 5، با غلظت ppb 5/62 و ppb125 در طی دوره‌های زمانی یاد شده فعالیت آنزیم CAT به‌ترتیب74/18، 86/11، 91/11،  nmol/min/ml/mg protein 22/16 و 1/21، 8/15، 04/15، nmol/min/ml/mg protein 22/39 ثبت گردید. در آکواریوم6، با غلظت ppb250 در طی دوره‌های زمانی یاد شده فعالیت آنزیم CAT به‌ترتیب 54/15، 8/18، 81/15،  nmol/min/ml/mg protein 97/15 ثبت گردید.

نتیجه‌گیری: همبستگی بین فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتازSOD)) و غلظت‌های مختلف نفت خام، در طول مدت در معرض‌گذاری به نفت خام وجود ندارد. همچنین مشخص شد که آنزیم CAT پارامتر حساس‌تری نسبت به SOD می‌باشد و می‌تواند بیومارکر مفیدی برای ارزیابی آلودگی در اکوسیستم‌های آبی در بارناکل‌های   Tetraclita rufotincta باشد.

واژه‌های کلیدی: آنزیم، کاتالاز، سوپراکسید دیسموتاز، نفت خام، بارناکل Tetraclita rufotincta، شرایط آزمایشگاه.

مقدمه

تأثیر فعالیت‌های انسانی روی محیط‌های دریایی در حال پیش‌روی است(1). انواع زیادی از آلاینده‌ها در جهان امروز وجود دارند که موجب آلودگی اکوسیستم های گوناگون می‌گردند. این مواد سمی به طرق مختلف وارد آب شده و آن را آلوده می‌سازند(2). این آلودگی‌ها توسط حیوانات بومی گرفته می‌شوند و سرانجام وجود آن‌ها را به مخاطره می‌اندازند. آشکارسازی تأثیرات پنهانی و کشنده این قبیل آلودگی‌ها روی موجودات مصب‌ها و دریاها در سطوح جامعه و جمعیتی موجودات زیستی اغلب حیرت‌آور است(1). بسیاری از ترکیبات اگزوژن  Exogen(ترکیباتی که از محیط خارج وارد یک اکوسیستم می‌شوند) که به‌عنوان زنوبیوتیک Xenobiotic نیز شناخته شده‌اند، سمی می‌باشند. این ترکیبات قادرند فعالیت‌های حیاتی موجودات زنده را مختل نموده و محیط زیست آبی را در معرض تهدید قرار دهند(3). یکی از آلودگی‌های محیطی نفت و مشتقات آن به‌ویژه هیدروکربن‌های آروماتیک PAHs است(4). برخی از هیدروکربن‌های آروماتیک چندحلقه ای (PAHs) به‌عنوان عوامل سرطان‌زا شناخته شده‌اند(5). موجودات زنده به حضور این آلاینده‌ها در اکوسیستم عکس‌العمل نشان می‌دهند. چنانچه واکنش موجودات و جمعیت‌ها در یک اکوسیستم آبی به این قبیل عوامل استرس‌زا توأم  با تغییر در برخی از پارامترهای بیوشیمیایی، فیزیولوژی و یا هیستوپاتولوژی باشد، اصطلاح بیومارکر برای آن  به‌کار برده می‌شود(6). به‌کارگیری بیومارکرها به‌عنوان یک روش اساسی در سنجش سلامت اکوسیستم به‌حساب می‌آید و منجر به کشف سریع تغییرات زیستی می‌شود(3). ساز و کار سم‌زدایی آلودگی‌های آلی در بدن موجودات زنده، شامل وارد شدن یک مجموعه آنزیمی اصلی ضمیمه شده به فازI (واکنش های اصلی) و فاز II (واکنش‌های توام) انتقال زیستی می‌باشد(7). ارگانیسم‌های آبی، زنوبیوتیک‌های آلی را به‌وسیله فاز I متابولیسم می‌کنند و منجر به تولید رادیکال‌های آزاد واکنشی (ROS)  Reactive oxygen species  می‌گردند(8). هیدروکربن‌ها و سایر ترکیبات حاصل از  متابولیت آن‌ها تولید ROS می‌کنند. در نهایت توسط چند فرایند مختلف نظیر اکسید شدن پروتئین، پراکسید شدن چربی و صدمه دیدن DNA، باعث افزایش آسیب سلولی می‌شوند. برای جلوگیری از چنین صدمه‌هایی سیستم‌های آنتی‌اکسیدانی آنزیمی و غیرآنزیمی برای حذف و برطرف نمودن تحریکات ROS فعال می‌شود. در این وضعیت، موجود این امکان را می‌یابد که استرس‌های اکسیداسیونی در محیط‌های آلوده را تحمل نموده و بر آن‌ها غلبه کند(9-11). بخشی از پاسخ های فیزیولوژیکی موجودات در مواجهه با این نوع مواد آلاینده شیمیایی به این صورت است که موجود ساز و کارهای دفاعی خود نظیر تولید آنتی‌اکسیدان‌ها و آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی را افزایش و توسعه می‌دهد(12). احیای رادیکال‌های سوپراکسید به‌وسیله آنزیم سوپراکسید دیسموتاز(SOD) و پراکسید هیدروژن به‌وسیله CAT از شکل‌گیری واسطه‌های تشکیل رادیکال از طریق ساز و کار احیای اکسیژن جلوگیری می‌نماید(9).  SODو CAT به‌عنوان اولین سری دفاعی آنتی‌اکسیدانی به افزایش سطوح آلودگی که تحریک‌کننده تولید ROS است، حساس می‌باشند (9،13،14). مقدار آسیب زیستی که رادیکال‌های اکسیژن آزاد شده می‌گذارند، به توان دفاعی آنتی‌اکسیدانی بستگی دارد. بنابراین آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان نقش حیاتی و مهمی را در حفظ هوموستازی سلول بازی می‌کنند(9). واکنش تحریک‌پذیری آنتی‌اکسیدان‌ها یک پاسخ ویژه نسبت به آلاینده‌ها محسوب می‌شود. بر این اساس آن‌ها به‌عنوان بیومارکرهای زیستی مواد آلاینده ایجادکننده استرس‌های اکسیداسیونی در بسیاری از موجودات زنده دریایی، ازجمله ماسل ها، مطرح و معرفی شده‌اند(11). در این وضعیت اکثریت کارها بر روی نرم‌تنان دوکفه‌ای، مخصوصاً ماسل‌ها و اویسترها متمرکز شده است، ولی اطلاعات کمی در مورد وجود این سیستم‌ها در سخت‌پوستان دریایی مثل بارناکل‌ها وجود دارد. فراوانی، چسبیدن به بستر و هرمافرودیت بودن آن‌ها، باعث می‌شود که این موجودات امکان خوبی برای این مطالعات به‌شمار روند(1). بارناکل‌ها دارای توانایی عمومی برای تجمع دادن زیستی و تغلیظ اغلب آلاینده‌ها، در بدن خود بوده و همچنین قادرند تا اندازه‌ای، مقادیری از این آلودگی‌ها را تحمل کرده و نسبت به آن مقاومت نشان دهند. بنابراین شناخت مقادیر تجمع یافته آلاینده‌ها در آن‌ها از موضوعات مهم مربوط به سلامتی انسانی است(6). رویکرد استفاده از مارکرهای زیستی که به‌تازگی در مجموعه حفظ محیط زیست قرار گرفته است، از اهمیت به‌سزایی برخوردار است به این منظور از آنتی اکسیدان‌ها در این مورد برای به صدا در آوردن زنگ خطر محیطی می‌توان استفاده کرد. بررسی‌های انجام یافته گویای وجود این پتانسیل بالقوه می‌باشد(1 و 16-14). سنجش‌های یک پارچه سطوح آلودگی‌های شیمیایی و پاسخ‌های بیومارکری به‌طور ممتد در بازبینی‌های آلودگی در محیط‌های دریایی در سال‌های اخیر به‌کار گرفته می‌شوند. هدف از این پژوهش، تعیین تأثیرات آلودگی نفتی بر سیستم آنتی‌اکسیدانی بارناکل‌ها و بررسی امکان معرفی این آنزیم‌ها به‌عنوان بیومارکر می‌باشد.

مواد و روش کار

1- زمان و مکان تحقیق

نمونه‌برداری از بارناکل‌ها طی سفر به منطقه نفتی  بهرگان (واقع در استان بوشهر) در آذر ماه 1387 و از پایه‌های سکوی نفتی نوروز صورت پذیرفت. نمونه‌ها توسط ضربات آرام وارد شده بر قلم از پایه‌های سکو جدا شده  و به‌همراه آب منطقه در یخدان توسط هلیکوپتر به آزمایشگاه شرکت نفت فلات قاره بهرگان انتقال یافتند. سپس، نمونه‌ها درون بسته‌های غیر قابل نفوذی که با چند لایه تنظیف و آب منطقه از قبل آماده شده بود، قرار گرفت. پس از هوادهی درب ظروف کاملاً بسته شد و داخل یخدان قرار گرفت و توسط هواپیما به تهران انتقال یافت(17،18).

2- شناسایی بارناکل

بارناکل‌های مورد آزمایش با توجه به تعداد، اشکال و موقعیت قرارگیری صفحات آهکی دیواره‌ای و همچنین وضعیت tergum و scutum، از جنس و گونه Tetraclita rufotincta شناسایی گردیدند(21-19).

3- انتقال و تطابق

پس از انتقال بارناکل‌ها به تهران، بلافاصله نمونه‌ها درون آکواریوم‌هایی که از قبل کاملاً شستشو و حجم‌سنجی شده و با حجم مساوی از آب پر شده بودند، قرار گرفتند. تعداد بارناکل‌ها در هر آکواریوم مساوی انتخاب شد(10). حداکثر تراکم بارناکل‌ها در هر آکواریوم به‌حدی بود، تا ضایعات و استرس‌های احتمالی را به حداقل برساند و فضولات ناشی از اعمال متابولیکی باعث بروز عوارض در موجودات و کیفیت آب نشود که با توجه به حجم بالای آکواریوم‌ها به‌طور متوسط برای هر آکواریوم تعداد 130 بارناکل در نظر گرفته شد(22). آب آکواریوم‌ها در طول مدت آزمایش تعویض نشد و تغذیه نیز صورت نگرفت. بارناکل‌ها به مدت 72 ساعت با شرایط آزمایشگاه سازگار شدند و سپس دوزهای نفتی به آکواریوم‌ها اضافه گردید(10).

4- شرایط آزمایشگاه

رطوبت اتاق آکواریوم ها توسط دستگاه بخور تأمین می‌شد. میزان دمای اتاق در 2± 20 درجه سانتی‌گراد. میزان pH آب 1/7 و شوری آب ppt24 بود (شوری آب منطقه نمونه‌برداری ppt27 اندازه‌گیری شد که برای ایجاد هماهنگی آداپتاسیون به مدت 72 ساعت در محیط آزمایشگاه صورت گرفت). نسبت روشنایی به تاریکی 12/12 در نظر گرفته شد(10).

5- شرح عملیات در معرض‌گذاری

پس از انقضای دوره آداپتاسیون بارناکل‌ها(10)، نفت خام منطقه نفتی بهرگان به‌میزان ppb250، 125، 5/62، 25/31، 625/15و ppb3 به‌عنوان شاهد(23)، به آکواریوم‌ها اضافه شد. از زمان انتقال بارناکل‌ها به آکواریوم‌های حاوی دوزهای نفتی، هر 24، 48، 72و 96 ساعت(10)، از هر دوز نفتی و آکواریوم تکرار آن 15 بارناکل خارج، درون فویل‌های آلومینیومی قرار گرفته و پس از کدگذاری بلافاصله به فریزر منتقل شد. این بارناکل‌ها برای تعیین تغییرات آنزیم‌های کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز مورد آزمایش قرار گرفتند(10).

6- سنجش آنزیم سوپراکسید دیسموتاز

سنجش آنزیم کاتالاز بر طبق روش کیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز انجام یافت(24).

7- سنجش آنزیم کاتالاز

سنجش آنزیم کاتالاز بر طبق روش کیت آنزیم کاتالاز انجام یافت(25).

8- آمار و پردازش

برای تحلیل داده‌ها از آنالیز واریانس یک‌طرفه و برای مقایسه نتایج از ضریب همبستگی در نرم افزار SPSS 16.0 استفاده شد(8،10،14) رسم نمودارها با استفاده از نرم افزار EXCEL انجام گرفت.

 یافته‌های تحقیق

در آکواریوم شاهد شماره 1 که دارای نفت خامی با غلظت ppb3 بود، در دوره زمانی 24 ساعت، فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز U/ml/ mg protein 98/128بوده است که نسبت به دوره‌های زمانی 48، 72 و 96 ساعت، دارای بیش‌ترین فعالیت می‌باشد. بعد از طی 48 ساعت فعالیت این آنزیم کاهش یافته و به  U/ml/ mg protein 04/30 رسیده است. در دوره زمانی 48 تا 72 ساعت، یک روند افزایشی در فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در آکواریوم شاهد مشاهده شده است که مجدداً با افزایش دوره زمانی و رسیدن به 96 ساعت، کاهش کمی در فعالیت این آنزیم ایجاد و به U/ml/ mg protein 05/62 رسیده است که این میزان نیمی از فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در 24 ساعت اولیه می‌باشد(نمودار شماره 1-الف).

در آکواریوم شماره 2 که در معرض نفت  با غلظت ppb 625/15 قرار داشت، از24 تا 72 ساعت یک روند کاهشی در فعالیتSOD ، به چشم می‌خورد و سپس فعالیت آنزیم به U/ml/ mg protein 109 می‌رسد که نزدیک به‌میزان فعالیت آنزیم در 24 ساعت اولیه می‌باشد. میزان فعالیت SOD در دوره‌های زمانی 24، 48 و 72 ساعت به‌ترتیب 45/104، 95/74 و U/ml/ mg protein 57/13 بوده است، میزان فعالیت 57/13کم‌ترین میزان فعالیت SOD در این آکواریوم و نیز در طول دوره در معرض‌گذاری می‌باشد(نمودارشماره1- ب). SOD در آکواریوم شماره 3 که در معرض نفت با غلظت ppb15/31 بود تقریباً یک روند فعالیتی کاهشی را طی دوره‌های زمانی 24، 48 و 72 ساعت داشته و از 96/69 به 56/61 و سپس به U/ml/ mg protein 5/60 رسیده، بعد از آن در زمان 96 ساعت فعالیت این آنزیم به U/ml/ mg protein 96/86 رسیده است(نمودارشماره1-ج). بیش‌ترین فعالیت SOD در آکواریوم شماره 4 که در معرض نفت با غلظت ppb 5/62 بود، بعد از 48 ساعت مشاهده شد. اگرچه در این آکواریوم در ابتدا میزان فعالیت در 24 ساعت، از 79/98 به U/ml/ mg protein 9/193 در 48 ساعت رسیده و یک روند افزایشی را نشان داده است، اما بعد از 72 ساعت میزان فعالیت به  U/ml/ mg protein75/42 می‌رسد، که تقریباً برابر با نیمی از فعالیت آنزیم در 24 ساعت اولیه در این آکواریوم می‌باشد، سپس یک روند افزایشی فعالیت از 72ساعت به 96 ساعت ایجاد و میزان فعالیت به U/ml/ mg protein 77/124 می رسد(نمودارشماره 1-د). در آکواریوم شماره 5 که در معرض نفت  با غلظت ppb125 نفت خام قرار داشت، بعد از 24 ساعت ، فعالیت آنزیم , SOD  U/ml/ mg protein 22/69 بود و بعد از آن با طی یک روند کاهشی به U/ml/ mg protein 08/40 در دوره زمانی 48 ساعت رسیده است. بیش‌ترین فعالیت SOD در این آکواریوم در 72 ساعت اتفاق افتاده است و کم‌ترین آن مربوط به 48 ساعت می‌باشد. در انتها فعالیت  SODبه  U/ml/ mg protein95/59 رسیده‌است(نمودارشماره 1- ه). در آکواریوم شماره 6 با غلظت نفت ppb 250، به‌جز در دوره زمانی 72 ساعت با فعالیت U/ml/ mg protein 71/20، یک روند افزایشی به چشم می‌خورد، میزان این فعالیت‌ها در دوره‌های زمانی مشخص شده به‌ترتیب 11/62، 1/87 و U/ml/ mg protein 47/93 بوده است(نمودار شماره 1- و).

نمودار 1- فعالیت آنزیم SOD بعد از 24، 48، 72 و 96 ساعت، به‌ترتیب در آکواریوم‌های با غلظت نفت خام: الف) آکواریوم شماره 1 (ppb3)،  ب) آکواریوم شماره 2 (ppb625/15)،  پ) آکواریوم شماره 3 (ppb 25/31)،   ت) آکواریوم شماره 4 (ppb5/62)،   ث) آکواریوم شماره 5 (ppb125)،   ج) آکواریوم شماره 6(ppb250)

فعالیت کاتالاز در آکواریوم شماره 1(شاهدppb3) با غلظت ppb3 نفت خام، با این که در هر دوره زمانی نسبت به دوره زمانی بعدی یک افزایش جزئی را نشان می‌دهد ولی در کل می‌توان گفت فعالیت آنزیم دارای یک روند منطقی بوده‌است. افزایش در فعالیت دوره‌های زمانی آکواریوم شاهد به‌ترتیب 29/13، 31/15، 5/15 و nmol/min/ml/mg protein 25/16 است (نمودار2-الف). در آکواریوم شماره   2(ppb625/15)، به‌جز در دوره زمانی 48 ساعت، CAT فعالیت ثابتی را نشان داده است. میزان تفاوت این فعالیت در 48 ساعت در حدود 3 بوده است. به‌ترتیب دوره‌های زمانی24، 48، 72 و 96ساعت، فعالیت آنزیم CAT 03/13، 74/16، 65/13 و nmol/min/ml/mg protein 61/13 بوده است(نمودار 2- ب). فعالیت کاتالاز در دوره‌های زمانی آکواریوم شماره 3(ppb15/31) نیز تقریباً در یک سطح بوده است و از nmol/min/ml/mg protein  46/11 پس از طی 24 ساعت به nmol/min/ml/mg protein 54/16 در 48 ساعت رسیده است که نشان‌دهنده افزایش در فعالیت CATمی‌باشد، سپس فعالیت این آنزیم یک دوره کاهشی را طی کرده و در 72 و 96ساعت دارای فعالیت‌های 7/15 و nmol/min/ml/mg protein 58/13 بوده است(نمودارشماره 2- ج). آنزیم‌های CATدر آکواریوم شماره 4 با غلظتppb 5/62 اگرچه در 24 ساعت اولیه با nmol/min/ml/mg protein 74/18 بیش‌ترین میزان فعالیت را در این آکواریوم به ثبت رسانده‌اند ولی در ادامه، غلظت‌های CAT به 86/11، 91/11 و  nmol/min/ml/mg protein 22/16 در زمان‌های 48، 72 و 96 ساعت رسیده است. می‌توان گفت CAT بعد از طی دوره 24 ساعته یک فعالیت بدون تغییری را در دوره‌های 48 و 72 ساعت طی کرده است و سپس یک افزایش جزئی در فعالیت این آنزیم در 96 ساعت مشاهده شده است(نمودار 2- د). بیش‌ترین فعالیت CAT در طول دوره آزمایشی در آکواریوم شماره 5(ppb125)، در دوره زمانی 96 ساعت رخ داده است. اما در دوره‌های 24، 48 و 72 ساعت، شاهد یک روند کاهشی هستیم و فعالیت CAT از  1/21 به nmol/min/ml/mg protein 8/15 و سپس  nmol/min/ml/mg protein 04/15 می‌رسد (نمودار 2- ه). آکواریوم شماره 6 با بالاترین غلظت نفت خام یعنی ppb250، در همه دوره‌ها به‌جز 48 ساعت، دارای فعالیت مساوی بوده است و در دوره 48 ساعت دارای فعالیت 8/18 می‌باشد. میزان فعالیت CAT در دوره‌های 24، 72 و 96 ساعت به‌ترتیب 54/15،  81/15 و  nmol/min/ml/mg protein 97/15 گزارش شده است(نمودار 2- و).

نمودار 2- فعالیت آنزیمCAT بعد از 24، 48، 72 و 96 ساعت، به ترتیب در آکواریوم‌های با غلظت نفت خام: الف) آکواریوم شماره 1 (ppb3)،  ب) آکواریوم شماره 2 (ppb625/15)،  پ) آکواریوم شماره 3 (ppb 25/31)،   ت) آکواریوم شماره 4 (ppb5/62)،   ث) آکواریوم شماره 5 (ppb125)،   ج) آکواریوم شماره 6(ppb250)

در طول دوره در معرض‌گذاری بارناکل‌ها به غلظت‌های مختلف نفت خام، بیش‌ترین میزان فعالیت آنزیم‌های SOD در دوره 24 ساعته، در غلظت ppb3 (آکواریوم شاهد) صورت گرفته است (نمودار شماره الف-3) و در دوره‌های 48، 72 و 96 ساعت به‌ترتیب غلظت‌های 5/62، 125 وU/ml/ mg protein 5/62 دارای بیش‌ترین فعالیت بوده‌اند(نمودار شماره 3- الف، ب، ج).

نمودار 3- فعالیت آنزیم SOD در غلظت‌های مختلف نفت خام، به تفکیک ساعت: الف) فعالیت آنزیم SOD در24 ساعت ب) فعالیت آنزیم SOD در48 ساعت پ) فعالیت آنزیم SOD در72 ساعت  ت) فعالیت آنزیم SOD در96 ساعت

بیش‌ترین میزان فعالیت CAT در دوره‌های زمانی 24و 96 ساعت در بین تمامی آکواریوم‌ها، در غلظت نفتی ppb125 (نمودارشماره 4- الف، ج) و در دوره‌های 48 و 72 ساعته در دوز نفتی ppb250 بوده است(نمودارشماره 4- ب، د).

نمودار 4- فعالیت آنزیمCAT در غلظت های مختلف نفت خام، به تفکیک ساعت: الف) فعالیت آنزیم CAT در24 ساعت ب) فعالیت آنزیم CAT در48 ساعت پ) فعالیت آنزیم CAT در72 ساعت  ت) فعالیت آنزیم CAT در96 ساعت

در اکثر موارد سطح فعالیت آنزیم SOD نسبت به سطح فعالیت آنزیم CAT بالاتر بوده ولی یک روال منطقی را طی  نکرده است(نمودار3و4).

نتایج به‌دست آمده از آنزیم سوپراکسید دیسموتازSOD)) نشان می‌دهد که همبستگی بین فعالیت آنزیم‌ها در بارناکل‌های در معرض‌گذاری شده به دوزهای مختلف نفت خام، در طول مدت آزمایش وجود ندارد.

جدول 1- تعداد مرگ و میر بارناکل‌ها در آکواریوم‌های مختلف تحت تأثیر قرار گرفته در غلظت‌های مختلف نفت خام.

بحث و نتیجه‌گیری

در طول دوره آزمایش، میزان مرگ و میر نمونه‌های بارناکل بعد از دوره‌های زمانی 24، 48، 72 و 96 ساعت ثبت گردید.

نتایج نشان داد در آکواریوم 1 با غلظت نفت خام ppb3، بعد از 24 ساعت هیچ‌گونه مرگ و میری مشاهده نشد، اما بعد از گذشت هر یک از زمان‌های 48، 72 و 96 ساعت به‌ترتیب تعداد 1، 1 و 3 بارناکل مردند. در آکواریوم تکرار1 نیز میزان مرگ و میر به‌ترتیب 0، 1، 0 و 2 بارناکل در طی  24، 48، 72 و 96 ساعت بود. در آکواریوم شماره 2 که دارای غلظت ppb625/15 بود، فقط در دوره 72 ساعت، 3 مرگ و میر و در دوره 96 ساعت 1 مرگ و میر داشتیم. اما در آکواریوم تکرار2 هیچ‌گونه مرگ و میری مشاهده نشد و در کل 4 عدد بارناکل در این آکواریوم مردند. در آکواریوم شماره 3 با غلظت ppb 25/31، 1 مرگ و میر در هر یک از دوره‌های 48 و 72 ساعت داشتیم که در تکرار 3 این میزان به 1 عدد در هر یک از دوره های 24 و 96 ساعت رسید. در آکواریوم شماره 4 که دارای غلظت ppb5/62 بود، تعداد 2 مرگ و میر بارناکل در هر یک از زمان‌های 72 و 96 ساعت دیده شد، بدین ترتیب میزان مرگ و میر‌های کل بارناکل‌ها در این آکواریوم به 4 عدد رسید و در آکواریوم تکرار 4 در کل 2 بارناکل مردند که در دوره‌های زمانی 24 و 96 ساعت بود. در آکواریوم شماره 5 با غلظت ppb125 مرگ و میری مشاهده نشد، اما آکواریوم تکرار آن دارای 3 مرگ و میر به‌ترتیب در دوره‌های 24، 72 و 96 ساعت بود. آکواریوم شماره 6 با غلظت بالایppb250 نیز فاقد مرگ و میر در بارناکل‌ها بود و تکرار این آکواریوم دارای 1 مرگ و میر در هر یک از دوره های 72 و 96 ساعت بود.

مقایسه نتایج مرگ و میر بارناکل‌ها نشان داد، تعداد مرگ و میرها ارتباط چندانی با افزایش غلظت‌های نفت خام تزریقی به آکواریوم‌ها ندارد، مثلاً در آکواریوم1 با غلظت ppb3 بیش‌ترین میزان مرگ و میر را داشتیم ( 5 عدد بارناکل)، اما در غلظت‌های بالا، یعنی 125 و ppb250 (آکواریوم‌های 5 و 6) مرگ و میری ثبت نگردید. از طرف دیگر مقایسه ارقام ثبت شده نشان می‌دهد که میزان مرگ و میر ها با افزایش دوره‌های در معرض‌گذاری افزایش می‌یابد، بدین ترتیب که کل مرگ و میر‌های ثبت شده در دوره‌های 24، 48 ، 72 و 96 ساعت در تمامی آکواریوم‌ها به‌ترتیب نشان دهنده تعداد مرگ و میر 3 ،3، 9 و 12 عدد بارناکل می‌باشد(جدول 1).

 در آزمایش حاضر، آنزیم‌های کاتالاز(CAT)، در غلظت نفتی ppb125 و در دوره زمانی 96 ساعت به حداکثر مقدار فعالیت خود رسیده‌اند و در غلظت‌های قبل از آن (ppb25/31، 62/15) تقریباً تغییرات ثابت بوده است و میزان سطح این آنزیم‌ها در دو آکواریوم با غلظت‌های ppb25/31 و 62/15تغییر محسوسی نسبت به سطح آنزیم‌های بارناکل‌های آکواریوم شاهد نداشته اند که می‌توان عنوان کرد، این آنزیم‌ها در این دوز‌های نفتی در حد اشباع بوده‌اند. بعد از افزایش سطح فعالیت آنزیم‌های کاتالاز در بارناکل‌های تحت تأثیر قرار گرفته با غلظت ppb125 و در دوره زمانی 96 ساعت، مجدداً فعالیت این آنزیم‌ها کاهش یافته و به میزان مشابه با دوزهای ppb25/31، 62/15، 3 رسیده است. این مطلب می‌تواند گویای این موضوع باشد که:

1- در این غلظت بالای نفتی (ppb250)، توان دفاعی آنتی‌اکسیدانی بارناکل‌ها کاهش یافته و سطح آنزیم‌های CAT نیز کاهش می‌یابد که در این صورت باید میزان بالایی از مرگ و میر را در بارناکل‌های این آکواریوم مشاهده کنیم. بیش‌ترین میزان مرگ و میر در بین آکواریوم‌ها در دوره زمانی 96 ساعت (در همه آکواریوم‌ها) صورت گرفته است و با توجه به این‌که هیچ‌گونه ارتباطی بین افزایش میزان مرگ و میر با افزایش دوزهای نفتی تزریق شده به آکواریوم‌ها وجود نداشته (با توجه به جدول 1، بیش‌ترین میزان مرگ و میر در آکواریوم با غلظت پایین یعنی آکواریوم شماره 3 صورت گرفته است)، می‌توان این‌طور بیان کرد که کاهش مواد غذایی در بین آکواریوم‌ها که به خاطر عدم تغذیه‌کنندگی بارناکل‌ها در طول دوره آزمایش صورت گرفته‌است، علت قوی‌تر این مرگ و میر می‌باشد(جدول 1).

2- آنزیم‌های کاتالاز بعد از در معرض قرارگیری به غلظت ppb125نسبت به دوزنفتی ppb250سازش پیدا کرده‌اند.

 در مطالعه حاضر در اکثر موارد سطح فعالیت آنزیم SOD نسبت به CAT بالا بــود، اما این آنزیم یک روال منطقی را طی نکرد. به‌طور کلی، آنزیم های سوپراکسید دیسموتاز در بارناکل‌های تحت تأثیر قرار گرفته با دوز نفتی ppb5/62 و در دوره زمـانی 48 ساعت دارای حداکثــر افــزایش در فعالیت می‌باشند، اما با توجه به این‌که تغییرات سطح فعالیت ایـن آنزیم‌ها در سایر آکواریوم‌ها یک روند منطقی را طی نکردند، نمی‌توان اظهار کرد که بیش‌ترین حساسیت موجود نسبت به آلودگی نفت خام، در این دوز نفتی بوده است. همچنین تغییرات سطح آنزیم کاتالاز در غلظت های مختلف نفت خام تقریباً یک روند ثابتی را داشته است و فقط در دوره زمانی 96 ساعته، در غلظت نفت خام ppb125 بیش‌ترین میزان نوسان در فعالیت کاتالاز دیده شد که می‌تواند بیانگر این موضوع باشد که کاتالاز دارای حساسیت بیش‌تری نسبت به آلودگی نفت خام در این دوز نفتی است، لذا می‌توان اظهار داشت با توجه به نتایج به‌دست آمده و مقایسه تغییرات سطح آنزیم کاتالاز((CAT و سوپراکسید دیسموتازSOD)) با میزان دوزهای نفت خام تزریقی به آکواریوم‌ها، کاتالاز در مقایسه با سوپراکسید دیسموتاز می‌تواند بیومارکر قوی‌تری در بارناکل  Tetraclita rufotincta باشد. 

با توجه به این‌که نتایج تست‌های سمیت انجام یافته در شرایط آزمایشگاهی اغلب به‌عنوان پایه پیش‌بینی‌های اکولوژیکی مطرح (10) و سنجش‌های آزمایشگاهی یک مرحله تعیین‌کننده را در تست‌کردن‌هــای تأثیــرات شیمیــایی میسـر می‌سازند، اما نمی‌توانند مستقیماً با محیط‌های طبیعی قیاس شوند زیرا هر دو فاکتورهای زنده و غیرزنده در پاسخ‌های ارگانیسم در محیط دخالت دارند(10). تغییرات سطح فعالیت آنزیم‌های کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز نسبت به غلظت‌های بالای آلاینده‌ها، با این‌که در بسیاری از آزمایش‌ها رابطه مستقیمی داشته است(1 و 16-14)، اما نمی‌تواند به‌عنوان یک روند عمومی به‌شمار رود، در برخی از آزمایش‌ها نیز عکس این مطلب وجود داشته است که شاید به‌دلیل دوره کوتاه در معرض‌گذاری موجود در مقابل آلاینده باشد که این خود باعث ایجاد نتایج ناپایداری در سطوح آنزیمی می‌گردد(9).

 منابع

1. Niyogi, S., Biswas, S., Sarker, S.and Datta, A.G., 2001. Antioxidant enzymes in brackishwater oyster, Saccostrea cucullata as potential biomarkers of polyaromatic hydrocarbon pollution in Hooghly Estuary (India): seasonality and its consequences.  The Science of the Total Environment 281. Pp. 237-246.
2. Dawes, C. J. 1998. Marine Botany. John wiley and sons. N. Y. Pp. 480.
3. کریم‌زاده، ک.، 1383. خالص‌سازی آنزیم سیتوکروم P4501A1 از کبد تاس ماهی ایرانی و طراحی روشELISA  برای سنجش آن. پایان‌نامه دکتری دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات.
4. عمیدی، ر.، 1383. بررسی و اندازه‌گیری عناصر سنگین (نیکل و وانادیوم) و هیدروکربن‌های نفتی در صدف خوراکی Saccostrea cucullata در محدوده جزر و مدی جزیره کیش. پایان‌نامه کارشناسی ارشد دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال. دانشکده علوم و فنون دریایی. آلودگی و حفاظت محیط زیست دریا.
5. کلارک، ار. بی.، 1997. آلودگی دریا. ترجمه زاهد، م. ع. عمیدی دشتی، ز. 1379. انتشارات نقش مهر. ص 103-65.
6. اسماعیلی‌ساری، ع.، 1381. آلاینده‌ها و بهداشت و استاندارد در محیط زیست. انتشارات نقش مهر. ص 590-598.
7. Bebianno, M., Lopes, B., Guerra, L., Hoarau, P. and Ferreira, M., 2007. Glutathione S-tranferases and cytochrome P450 activities in Mytilus galloprovincialis from the South coast of Portugal: Effect of abiotic factors.  Environment International 33. Pp. 550–558.
8. Orbea, A., Ortiz-Zarragoitia, M., Sole, M., Porte, C. and Cajaraville, M., 2001.  Antioxidant enzymes and peroxisome proliferatin in relation to contaminant body burdens of PAHs and PCBs in bivalve mollusks, crab and fish from the Uradaibai and  plentzia estuaries (Bay of Biscay). Aquatic Toxicology 58. Pp. 75-98.
9. Cheung, C.C.C., Zheng, G.s., Lig, A.M.Y., Richardson, B.J. and Lam, P.K.S., 2001.  Relationships between tissue concentrations of polycyclic aromatic hydrocarbons and antioxidative responses of marine mussels, perna riridis. Aquatic Toxicology 52. Pp. 189-203.
10. Reid, D. J. Macfarlane, G.R.  2003.  Potential biomarkers of crude oil exposure in the gastropod mollusc, Austrocochlea poecata: Laboratory and manipulative field studies.  Environmental pollution 12. Pp. 147-155.
11. Lima, I. Moreira, S.M. etc. 2007  Biochemical responses of  the  marine mussel  Mytilus galloprovincialis  to petrochemical environmental  contamination along the North-Western cost of Portugal.  Chemosphere 66. 1230-1242.
12. Luca-Abbott, S.B.  Richardson, B.J. Mcclellaw, K.E. Zheng, G.J. Mrtin, M. Lam, P.K.S.  2005.   Field validation of antioxidant enzyme biomarkers in mussels perna riridis and clams Ruditapes philippinarrum transplanted in Hong Kong coastal waters.  Marine Pollution Bulletin 51. 694-707.
13. Matozzo, V., Ballarin, L. and Gabriella Marin, M., 2004.   Exposure of the calm Tapes philippinarum to 4-nonylphenol: changes in anti-oxidant enzyme activities and re-burrowing capability. Marine pollution Bulletin 48. 563-571.
14. Box, A., Sureda, A., Galgani, F., Pons, A. and Deuderi, S., 2007.  Assessment of environmental pollution at Blearic Islands applying oxidative stress biomarkers in mussel Mytilus galloprovincialis. Comparative Biochemistry and physiology part c146. 531-539.
15. Cajaraville, M.P., Ortiz-Zarragoitia, M., 2006. Specificity of the peroxisome proliferation response in mussels exposed to environmental pollutants. Aquatic Toxicology 78S. Pp. S117-S123.
16. Niyogi, S., Biswas, S., Sarker, S. and Datta, A.G., 2000. Seaonal variation of antioxidant and biotransformation enzymes in barnacle, Balanus balanoides, and their relation with polyaromatic hydrocarbons. Marine Environmental research 25. Pp. 13-26.
17. رحمانی، م. 1380. مطالعه تولید مثل کشتی‌چسب دریای خزر. پایان‌نامه کارشناسی ارشد زیست‌شناسی. دانشکده علوم. دانشگاه تهران. ص 2-12.
18. راس، ل و راس، ب. 1384. ترجمه میرزرگر، س و صیدگر، م. فنون بیهوشی و تسکین در آب‌زیان. انتشارات دانشگاه تهران. 246ص.
19. Benny K. K. Chan. 2001. Studies on Tetraclita Squamosa and Tetraclita Japonica (Cirripedia: Thoracica). I: ADULT MORPHOLOGY. Journal of Crustacean Biology 21(3). Pp. 616-630.
20. Benny K. K. chan, l. M. Tsang, K. Y. Ma, c.-H. Hsu, and K. H. chu. 2007. Taxonomic revision of the acorn barnacles Tetraclita japonica and Tetraclita formosana (Crustacea: Cirripedia) in East Asia based on molecular and morphological analyses. BULLETIN OF MARINE SCIENCE, 81(1). Pp. 101–113.
21. شهدادی، ع.، 1385. تاکسونومی و جغرافیای زیستی کشتی‌چسب‌های بین جزر و مدی خلیج فارس و دریای عمان. پایان‌نامه کارشناسی ارشد زیست‌شناسی. دانشکده علوم. دانشگاه تهران.
22. Shaw, J. P., Large, A. T., Livingstone, D. R., Doyotte, A., Renger, J., Chipman, J. K. and Peters, L. D. 2002. Elevation of cytochrome P450-immunopositive protein and DNA damage in mussels (Mytilus edulis) transplanted to a contaminated site.  Marine Environmental Research. NO. 54. Pp. 505-509.
23. Livingstone. D. R., 1988. Responses of microsomal NADPH-cytochrome c reductase activity and cytochrome P-450 in digestive glands of Mytilus edulis and Littorina littorea to environmental and experimental exposure to pollutants.  Vol. 46: 37-43, l MARINE ECOLOGY - PROGRESS SERIES Mar. Ecol. Prog. Ser. I Published June 30.
24. Cayman Chemical Company, 2008. Superoxide Dismutase Assay Kit, Catalog No 706002.
25. Cayman Chemical Company, 2008. Catalase Assay Kit, Catalog No 707002.

Relationship between labratory exposure to crude oil and antioxidative responses of Tetraclita rufotincta barnacles

Mojgan Emtyazjoo[6]

Lida Salimi[7]

Majid Zeinali[8]

Bahar SHahabi[9]

Maryam Ghasempour maleki[10]

Abstract

Introduction: Nowdays the destructive effects of oil pollutions that produced by different resources in waters and aquatic organisms have been defined. With the intention of studing effects of crude oil in different concentration, on variations of ontioxidant enzymes level(SOD, CAT)in Tetraclita rufotincta and the possibility of introduce these enzymes as biomarkers.

Metod: Barnacles Tetraclita rufotincta were sampled in Bahrekan region. Barnacles exposed to 250ppb, 125ppb, 62.5ppb, 31.25ppb, 15.625ppb and 3ppb as a control, crude oil after 24,48,72 and 96 h. 15 barnacles removed from aquarium in average. Animals were examined for levels of Antioxidants enzymes (SOD, CAT) in their tissues.

Results: this study detected that in aquarium 1, with 3ppb concentration, after 24,48,72 and 96 h Superoxide dismutase(SOD) activities shown respectively 128/98, 30/04, 75/8, 62/05U/ml/mg protein. In aquarium 2 and 3, with 15.625ppb and 31.25ppb concentration, after the period mentioned, superoxide dismutase(SOD) activities shown respectively 104/45, 74/95, 13/57, 109U/ml/mg protein and 69/96, 61/56, 60/5, 86/46 U/ml/mg protein. In aquarium 4 and 5, with 62.5ppb and 125ppb concentration, after the period mentioned, Superoxide dismutase(SOD) activities shown respectively 98/79, 193/9, 42/75, 124/77 U/ml/mg protein and 69/22, 40/08, 81/86, 59/95U/ml/mg protein and in aquarium 6, with 250ppb concentration, after the period mentioned, Superoxide dismutase(SOD) activities shown respectively 62/11, 87/1, 20/71, 93/47U/ml/mg protein.

The results also detected that in aquarium 1, with 3ppb concentration, after 24,48,72 and 96 h Catalase (CAT) activities shown respectively 13/29, 15/31, 15/5, 16/25 U/ml/mg protein. In aquarium 2 and 3, with 15.625ppb and 31.25ppb concentration, after the period mentioned, Catalase (CAT) activities shown respectively 13/03, 16/74, 13/65, 13/61U/ml/mg protein and 11/46, 16/54, 15/7, 13/58U/ml/mg protein. In aquarium 4 and 5, with 62.5ppb and 125ppb concentration, after the period mentioned, Catalase (CAT) activities shown respectively 18/74, 11/86, 11/91, 16/22U/ml/mg protein and 21/1, 15/8, 15/04, 39/22U/ml/mg protein and in aquarium 6, with 250ppb concentration, after the period mentioned, Catalase (CAT) activities shown respectively 15/54, 18/8, 15/81, 15/97U/ml/mg protein.

Conclusion: There was no correlation between Superoxide dismutase (SOD) activities and different concentrations of crude oil, during the animals exposed to crude oil. It also detected that CAT enzyme is sensitive parameter than SOD and that could be useful biomarker for the evaluation of contaminated aquatic ecosystems in Tetraclita rufotincta barnacles.

Key word: Enzymes, Catalase, superoxide dismutase, crude oil, Tetraclita rufotincta barnacles, lab conditions